Lo sviluppo e l'applicazione di saggi biofisici per la valutazione della formazione di complessi ternari indotti da chimere mirate alla proteolisi (PROTACS)

La poliubiquitinazione delle proteine nella cellula è un processo strettamente regolato che coinvolge gli enzimi della famiglia delle ubiquitina ligasi ^1,2. Gli enzimi terminali nella via sono le ubiquitina ligasi E3 che legano covalentemente le molecole di ubiquitina ai loro partner che legano le proteine³. La poliubiquitinazione di questi partner di legame proteico li indirizza alla degradazione proteolitica da parte del proteasoma⁴. Questo sistema fa parte del processo di omeostasi proteica che è stato sfruttato terapeuticamente per indurre la degradazione delle proteine coinvolte nella malattia⁵. Le piccole molecole che inducono l’interazione tra le ubiquitina ligasi E3, come la ligasi E3 di Von Hippel-Lindau (VHL) o il cereblon (CRBN), sono tipicamente composte da una testata legante la ligasi E3 collegata da un linker flessibile a una testata che si lega alla proteina bersaglio per la degradazione. Queste molecole eterobifunzionali sono comunemente indicate come chimere mirate alla proteolisi o PROTACS⁶.

Lo sviluppo di PROTACS comporta la valutazione della capacità delle molecole di indurre la degradazione delle proteine nelle cellule. Sono stati sviluppati molti sistemi di saggi cellulari che monitorano l’interazione indotta tra la proteina bersaglio e i componenti della ligasi E3, come VHL o CRBN, dopo il trattamento delle cellule con una molecola PROTAC. Uno di questi saggi cellulari, il sistema nanoluc-Halotag⁷, coinvolge una ligasi E3 fusa all’accettore Halotag e una proteina bersaglio marcata con un donatore nanoluc. La formazione del complesso ternario porta il donatore di nanoluc e l’accettore di Halotag in prossimità, consentendo il trasferimento di energia dal donatore all’accettore con conseguente emissione di luce. Le variazioni di questo sistema possono essere utilizzate per valutare la permeabilità cellulare delle molecole PROTACS⁸ o i cambiamenti nel livello relativo di ubiquitinazione della proteina bersaglio⁹. Mentre questi sistemi cellulari sono essenziali per guidare l’ottimizzazione di PROTACS, la formazione di complessi tra le ligasi E3 e le proteine mirate alla degradazione è un processo a più fasi^10,11. La cinetica e la termodinamica delle interazioni binarie e ternarie coinvolte contribuiscono all’ubiquitinazione dell’efficienza e alla conseguente degradazione della proteina^12,13,14.

Di seguito sono descritti protocolli che possono essere adattati per la caratterizzazione biofisica della formazione di complessi ternari indotti da PROTACS utilizzando la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l’interferometria del biostrato (BLI) e la calorimetria di titolazione isotermica (ITC). I protocolli SPR e ITC per la molecola MZ1 PROTAC che induce la formazione di complessi ternari tra Brd4,^BD2 e VHL derivati dai rapporti di letteratura^13,15 e qui descritti sono stati in grado di ricapitolare i risultati riportati con alcune modifiche alle procedure riportate^, che verranno discusse. In questo rapporto è inclusa una descrizione di un saggio BLI utilizzato per valutare la formazione di complessi ternari tra MZI, Brd4^BD2 e VHL. Le misurazioni dell’affinità da BLI sono risultate coerenti con quelle osservate in SPR e ITC. Viene inoltre descritto un protocollo precedentemente pubblicato in cui è stato sviluppato un saggio SPR per valutare la formazione di complessi ternari indotti da PROTAC tra PPM1D, una proteina fosfatasi Ser/Thr la cui espressione è indotta in modo p53-dipendente¹⁶, e CRBN. In questo caso, la molecola PROTAC ha un’affinità nanomolare per PPM1D ma solo un’affinità micromolare per CRBN. In questo caso, il legame della molecola PROTAC al CRBN non è saturabile, con conseguente “effetto gancio” comunemente osservato. L’effetto gancio è una proprietà di tre sistemi di corpi in cui ci sono due specie che possono formare un complesso eterotrimerico quando entrambe sono legate a una molecola ponte (Figura 1)¹⁷. L’effetto gancio si osserva quando la specie ponte è in concentrazione eccessiva rispetto alle altre due specie. Lo stato risultante è quello in cui le interazioni binarie superano le interazioni ternarie. I sistemi in cui si osserva l’effetto gancio richiedono specifiche considerazioni di progettazione sperimentale discusse in questo rapporto. Vengono forniti i concetti generali e i requisiti dei reagenti per la valutazione dell’utilizzo di saggi biofisici per la valutazione della formazione di complessi ternari indotti da PROTAC.