le développement et l’application de tests biophysiques pour l’évaluation de la formation de complexes ternaires induite par la protéolyse ciblant les chimères (PROTACS)

La polyubiquitination des protéines dans la cellule est un processus étroitement régulé qui implique des enzymes de la famille des ubiquitines ligases ^1,2. Les enzymes terminales de la voie sont les ubiquitine ligases E3 qui attachent de manière covalente les molécules d’ubiquitine à leurs partenaires de liaison aux protéines³. La polyubiquitination de ces partenaires de liaison aux protéines les cible pour la dégradation protéolytique par le protéasome⁴. Ce système fait partie du processus d’homéostasie des protéines qui a été exploité thérapeutiquement pour induire la dégradation des protéines impliquées dans la maladie⁵. Les petites molécules qui induisent l’interaction entre les ligases de l’ubiquitine E3, telles que la ligase E3 de Von Hippel-Lindau (VHL) ou le cerveau (CRBN), sont généralement composées d’une ogive de liaison à la ligase E3 reliée par un liant flexible à une ogive qui se lie à la protéine ciblée pour la dégradation. Ces molécules hétérobifonctionnelles sont communément appelées chimères ciblant la protéolyse ou PROTACS⁶.

Le développement de PROTACS consiste à évaluer la capacité des molécules à induire la dégradation des protéines dans les cellules. De nombreux systèmes de dosage cellulaire ont été développés pour surveiller l’interaction induite entre la protéine cible et les composants de la ligase E3, tels que VHL ou CRBN, lors du traitement des cellules avec une molécule PROTAC. L’un de ces tests cellulaires, le système nanoluc-Halotag⁷, implique une ligase E3 fusionnée à l’accepteur Halotag et une protéine cible marquée avec un donneur nanoluc. La formation d’un complexe ternaire rapproche le donneur nanoluc et l’accepteur Halotag, ce qui permet le transfert d’énergie du donneur à l’accepteur, ce qui entraîne l’émission de lumière. Les variations de ce système peuvent être utilisées pour évaluer la perméabilité cellulaire des molécules PROTACS⁸ ou les changements dans le niveau relatif d’ubiquitination de la protéine cible⁹. Bien que ces systèmes cellulaires soient essentiels à l’optimisation de PROTACS, la formation de complexes entre les ligases E3 et les protéines ciblées pour la dégradation est un processus en plusieurs étapes^10,11. La cinétique et la thermodynamique des interactions binaires et ternaires impliquées contribuent à l’ubiquitination de l’efficacité et à la dégradation de la protéine^12,13,14 qui en résulte.

On y décrit des protocoles qui peuvent être adaptés pour la caractérisation biophysique de la formation de complexes ternaires induite par PROTACS à l’aide de la résonance plasmonique de surface (SPR), de l’interférométrie de biocouche (BLI) et de la calorimétrie de titrage isotherme (ITC). Les protocoles SPR et ITC pour la molécule MZ1 PROTAC qui induit la formation de complexes ternaires entre Brd4^BD2 et VHL dérivés des rapports de littérature^13,15 et décrits ici ont permis de récapituler les résultats rapportés avec quelques modifications des procédures rapportées^, qui seront discutées. Une description d’un test BLI utilisé pour évaluer la formation de complexes ternaires entre MZI, Brd4^BD2 et VHL est incluse dans ce rapport. Les mesures d’affinité de BLI étaient cohérentes avec celles observées dans le SPR et l’ITC. Un protocole précédemment publié dans lequel un test SPR a été développé pour évaluer la formation de complexes ternaires induite par PROTAC entre PPM1D, une protéine phosphatase Ser/Thr dont l’expression est induite de manière dépendante de p53¹⁶, et CRBN est également décrit. Dans ce cas, la molécule PROTAC a une affinité nanomolaire pour PPM1D mais seulement une affinité micromolaire pour CRBN. Dans ce cas, la liaison de la molécule PROTAC au CRBN n’est pas saturable, ce qui entraîne l’« effet crochet » couramment observé. L’effet d’hameçon est une propriété de trois systèmes corporels dans lesquels il y a deux espèces qui peuvent former un complexe hétérotrimérique lorsque les deux sont liées à une molécule de pontage (Figure 1)¹⁷. L’effet d’hameçon est observé lorsque l’espèce pontière est en concentration excessive par rapport aux deux autres espèces. L’état résultant est un état dans lequel les interactions binaires surpassent les interactions ternaires. Les systèmes où l’effet d’hameçon est observé nécessitent des considérations spécifiques sur la conception expérimentale discutées dans le présent rapport. Des concepts généraux et des exigences en réactifs pour l’évaluation de l’utilisation de tests biophysiques pour l’évaluation de la formation de complexes ternaires induite par PROTAC sont fournis.