Nierorganoïden genereren in suspensie van geïnduceerde pluripotente stamcellen
Summary
Dit protocol presenteert een uitgebreide en efficiënte methode voor het produceren van nierorganoïden uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) met behulp van suspensiekweekomstandigheden. De primaire nadruk van deze studie ligt op de bepaling van de initiële celdichtheid en de WNT-agonistconcentratie, wat ten goede komt aan onderzoekers die geïnteresseerd zijn in nierorganoïde-onderzoek.
Abstract
Nierorganoïden kunnen op verschillende manieren worden gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s). Deze organoïden zijn veelbelovend voor ziektemodellering, screening van geneesmiddelen en mogelijke therapeutische toepassingen. Dit artikel presenteert een stapsgewijze procedure om nierorganoïden te maken van iPSC’s, beginnend bij de posterieure primitieve streep (PS) tot het intermediaire mesoderm (IM). De aanpak is gebaseerd op het APEL 2-medium, een gedefinieerd, dierlijk componentvrij medium. Het wordt aangevuld met een hoge concentratie WNT-agonist (CHIR99021) gedurende een duur van 4 dagen, gevolgd door fibroblastgroeifactor 9 (FGF9)/heparine en een lage concentratie CHIR99021 gedurende nog eens 3 dagen. Tijdens dit proces wordt de nadruk gelegd op het selecteren van de optimale celdichtheid en CHIR99021 concentratie aan het begin van iPSC’s, aangezien deze factoren van cruciaal belang zijn voor een succesvolle generatie van nierorganoïden. Een belangrijk aspect van dit protocol is de suspensiecultuur in een laag klevende plaat, waardoor de IM zich geleidelijk kan ontwikkelen tot nefronstructuren, die glomeraire, proximale buisvormige en distale buisvormige structuren omvatten, allemaal gepresenteerd in een visueel begrijpelijk formaat. Over het algemeen biedt dit gedetailleerde protocol een efficiënte en specifieke techniek om nierorganoïden te produceren uit verschillende iPSC’s, wat zorgt voor succesvolle en consistente resultaten.
Introduction
De nier speelt een cruciale rol bij het handhaven van fysiologische homeostase, afhankelijk van de functionele eenheid. Nefronen, die afvalstoffen uitscheiden, kunnen de samenstelling van lichaamsvloeistoffen reguleren. Chronische nierziekte (CKD), veroorzaakt door erfelijke mutaties of andere risicofactoren, zal uiteindelijk evolueren naar nierziekte in het eindstadium (ESKD)1,2. ESKD is blijkbaar te wijten aan de beperkte regeneratiecapaciteit van nefronen. Nierfunctievervangende therapie is dus vereist. Gerichte differentiatie van humane iPSC’s maakt het mogelijk om in vitro patiëntspecifieke 3D-nierorganoïden te genereren, die kunnen worden gebruikt om de ontwikkeling van de nieren te bestuderen, patiëntspecifieke ziekten te modelleren en nefrotoxische screening uit te voeren 3,4.
Tijdens de embryonale ontwikkeling zijn de nieren afkomstig van het intermediaire mesoderm (IM), dat zich onderscheidt van de primitieve streep (PS). De klassieke WNT-signaleringsroute kan aanvullende differentiatie van IM induceren met de gecoördineerde deelname van FGF (FGF9, FGF20) en BMP (Bmp7-signalering via JNK)5,6,7. Ze produceren twee belangrijke celpopulaties van nefrische voorlopercellen (NPC): de ureterknop (UB) en het metanefrische mesenchym (MM), die respectievelijk de verzamelkanalen en het nefron vormen. Elk nefron bestaat uit glomerulaire en buisvormige segmenten, zoals de proximale en distale tubuli, en de lus van Henle10,11. Volgens de hierboven genoemde theorie bootsen de momenteel gepubliceerde protocollen de signaalcascades en groeifactorstimulatie na om nierorganoïden te induceren 5,12.
In de afgelopen jaren zijn er veel protocollen ontwikkeld om menselijke iPSC’s te differentiëren in nierorganoïden 5,6,7,12. Takasato et al.7 optimaliseerden de duur van de behandeling met CHIR (WNT-agonist) vóór vervanging door FGF9. Volgens hun protocol is CHIR-blootstelling gedurende 4 dagen, gevolgd door FGF9 gedurende 3 dagen, de meest effectieve manier om IM van iPSC’s te induceren. Transwell-filters werden gebruikt als het kweekformaat in hun procedure; Deze methode is echter moeilijk voor beginners. Daarom probeerden Kumar et al.13 het cultuurformaat te veranderen en kozen ze ervoor om de cultuur op te schorten. Ze dissocieerden de aanhangende cellen op dag 7 om in laaghangende platen te zaaien om ze te helpen zich te assembleren tot embryoïde lichamen (EB’s) die nefronachtige structuren bevatten. Het batcheffect van deze methoden was echter duidelijk, vooral bij verschillende iPSC’s. Bovendien meldde verschillende literatuur dat de concentratie van CHIR varieerde van 7 μM tot 12 μM 5,13,14.
We speculeerden dat de concentratie van celdichtheid en de CHIR de aanmaak van organoïden in verschillende iPSC’s zou kunnen beïnvloeden, en dit is talloze keren geverifieerd in onze experimenten. Het huidige protocol heeft de onderzoeksmethode van Kumar et al.13 enigszins gewijzigd en gebruikers een stapsgewijze procedure geboden. Het schema en het schema van de aanpak zijn weergegeven in figuur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er is een gedetailleerd protocol beschreven voor het genereren van nierorganoïden uit iPSC’s, waarbij kleine wijzigingen worden aangebracht in het basale medium, de initiële celdichtheid en de concentratie van CHIR99021. In verschillende experimenten bleken de kritische factoren voor het succesvol genereren van nierorganoïden de initiële differentiatie van het intermediaire mesoderm (IM) en de celtoestand op dag 7 te zijn. Bovendien vertoonden verschillende iPSC-lijnen variaties in celproliferatie en differentiatiepo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn alle leden van Mao en Hu Lab, vroeger en nu, enorm dankbaar voor de interessante discussies en geweldige bijdragen aan het project. We danken het National Clinical Research Center for Child Health voor de geweldige steun. Deze studie werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (U20A20351 aan Jianhua Mao, 82200784 aan Lidan Hu), de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang in China (nr. LQ22C070004 aan Lidan Hu), en de Natural Science Foundation van de provincie Jiangsu (subsidies nr. BK20210150 aan Gang Wang).
Materials
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 |
|
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Referências
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease – a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Biologia do Desenvolvimento. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361 (2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
