בידוד נוירונים היפותלמיים ממוקדים למחקרים על ויסות הורמונלי, מטבולי וחשמלי

הערה: מבט כללי על הליך הניסוי מומחש באופן גרפי באיור 1A. כל הניסויים בעכברים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המוסד שלנו (IACUC). השתמשנו בעכברי C57BL6/J בני 3 חודשים, ששוכנו בוויבריום מאושר על ידי האגודה להערכה והסמכה של Laboratory Animal Care International (AAALAC), תחת השגחתו של וטרינר. העכברים חיו בכלובים גדולים, עם מחזור אור-חושך של 12 שעות, והוזנו אד ליביטום. 1. התעברות ואימות הריון מקם עכברים מכל רקע וגנוטיפ של עניין לרבייה. רשום את התאריך והמשקל של הנקבה לפני ההתעברות. לאחר 6 שעות, בדוק את הנקבה עבור לוח עם בדיקה. אם הלוח קיים, להפריד את הנקבה מן הזכר. אם הפלאק אינו נוכח, השאירו את הנקבה בכלוב עד למחרת, ואז הפרידו את העכברים. בימים 7, 10 ו -14 לאחר ההתעברות, לשקול את הנקבה כדי לאשר הריון. 2. מדיה, צלחת 24 בארות והכנת חומרים ביום בידוד התא, יש להניח את כיסויי הזכוכית המצופים פולי-D-ליזין מוכנים לשימוש (ראו טבלת חומרים) בצלחת בת 24 בארות כדלקמן:מתחת למכסה מנוע ביולוגי, יש לעקר אריזה אחת המכילה 15 כיסויים עם 70% אתנול ולתת לה להתייבש. פתחו את האריזה והניחו את הכיסויים בצלחת בקוטר 60 מ”מ. נערו את הצלחת אופקית כדי להפריד בין הכיסויים. לאחר מכן, הפוך את הצלחת כדי להרים כיסויים בודדים כדי להיות ממוקם בבארות של צלחת 24 בארות. שטפו את הכיסויים פעם אחת עם 1.0 מ”ל של תמיסת מלח מאוזנת סטרילית של האנק (HBSS) למשך 5 דקות. בינתיים, הכינו 20.0 מ”ל של חומרי ציפוי באופן הבא: ל-18.31 מ”ל BME (Basal Medium Eagle, + Earle’s Salts), בתוספת 1.0 מ”ל של סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), הוסיפו 200 מיקרוליטר נתרן פירובט (מציר 100x), 200 מיקרוליטר גלוטמין (ממלאי של 200 ננומטר) ו-100 מיקרוליטר פניצילין/סטרפטומיצין (ממלאי של 200x). החלף את HBSS בבארות עם 1.0 מ”ל של מדיה ציפוי ומניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C. בעזרת מבער בונזן, מלטשים באש שלוש פיפטות פסטר בקטרים הולכים ופוחתים. מחזיקים את הצינור ביד אחת, מכניסים את הקצה ללהבה ומסירים אותו במהירות. חזרו על התהליך עד שהקצה מחליק והקוטר מצטמצם לקוטר הרצוי (מוערך על ידי העין). 3. הכנת מגיב לדיסוציאציה של רקמות עצביות, בהתאם להוראות ערכת הדיסוציאציה העצבית לאחר חימום מאגר העיכול 1 בטמפרטורת החדר, הכינו את Enzyme Mix 1 על ידי ערבוב 50 μL של אנזים 1 עם 1.91 מ”ל של Buffer 1 ואת Enzyme Mix 2 על ידי ערבוב 15 μL של אנזים 2 עם 30 μL של Digestion Buffer 2. התערובות מספיקות כדי לשמש לרקמת המוח של כל העוברים. הכינו אלבומין בסרום בקר 0.5% (BSA) ב-HBSS, לדוגמה, 0.25 גרם ב-50.0 מ”ל HBSS. 4. חילוץ עוברים הוציאו שני מלקחיים דקים ישרים, מלקחיים נקודתיים מעוקלים וזוג אחד של מספריים כירורגיים עדינים ועיקרו אותם באתנול 70% לפני השימוש. לאחר מכן, מלאו את צלחות הפטרי ב- HBSS. יש להרדים סכר הרה E14-E16 אחד בתא CO2 ולבצע פריקת צוואר הרחם.הערה: יש לבצע את השלבים הבאים מתחת למכסה המנוע בתנאים סטריליים: לעקר את הבטן עם 70% אתנול. לפתוח את חלל הבטן מן סימפיזת הערווה לתהליך xiphoid של כלוב הצלעות עם מספריים כירורגיים ומלקחיים. מוציאים את קרן הרחם ומניחים אותה בצלחת בקוטר 100 מ”מ מלאה בHBSS קר כקרח ושוטפים היטב. לחלץ ולהפריד את כל העוברים מהרחם עם מלקחיים עדינים. ערפו במהירות את ראשיהם של העוברים בעזרת מספריים כירורגיים עדינים ו/או מלקחיים. מניחים את הראשים בצלחת פטרי 60 מ”מ מלאה HBSS. 5. מיצוי היפותלמוס, איסוף, ודיסוציאציה של רקמות הניחו מלקחיים עדינים בחלל העין כדי להחזיק את המוח. בעזרת המלקחיים העדינים האחרים, הסירו את העור ואת הגולגולת על ידי קילוף עד שהמוח נראה לעין. להבדיל את המוח מרקמות אחרות על סמך המראה הלבן שלו. העור והגולגולת ורודים ועשירים בכלי דם. הוציאו את המוח מהגולגולת באמצעות מלקחיים נקודתיים מעוקלים וגרפו את המוח מנורות הריח, והפכו אותו הפוך. כעת קליפת המוח היא גחון, וההיפותלמוס נראה באופן דורסלי על פני השטח העליונים (איור 1B). בעזרת המלקחיים המעוקלים, הסירו את שכבת קרומי המוח וכלי הדם עד שהמוח נראה לבן וצלול. בעזרת המלקחיים המעוקלים, מפרידים את אזור ההיפותלמוס משאר המוח. חותכים את ההיפותלמוס ל 3-4 חתיכות קטנות עם pipet, להעביר את החתיכות לתוך צינור 15 מ”ל. חזור על השלבים עבור העוברים האחרים בזמן שהצינור על קרח. מלאו את הצינורית ב-6.0 מ”ל HBSS ותנו לרקמה לשקוע, הסירו את הסופר-נטנט והוסיפו את Enzyme Mix 1. מערבבים בעדינות ומסעירים את הצינור כדי למנוע את הרקמה. לדגור על הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולעורר את הרקמה כל 5 דקות כדי להשהות מחדש את הרקמה. לאחר 15 דקות, הוסיפו 30 מיקרוליטר של תערובת אנזימים 2. לנתק את רקמת המוח באמצעות פיפטה פסטר עם הקוטר הגדול ביותר (<1 מ"מ). פיפט למעלה ולמטה פי 10 מבלי ליצור בועות. לדגור במשך 10 דקות ב 37 ° C באמבט המים. בעדינות לעורר את הצינור כדי להשעות מחדש את הרקמה כל 5 דקות. לאחר 10 דקות, הוסיפו את 15 μL הנותרים של תערובת אנזימים 2. נתקו את הרקמה פי 10 עם שתי פיפטות מלוטשות אש אחרות בקוטר הולך ופוחת, למעלה ולמטה מבלי ליצור בועות. לצינור עם הרקמה המנותקת, הוסף מיד 10.0 מ”ל של HBSS-0.5% BSA וצנטריפוגה ב 300 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-1.0 מ”ל של HBS-0.5% BSA. 6. ספירת תאים דללו את תרחיף התא ביחס 1:5 באמצעות HBSS-0.5% BSA. מניחים 10 μL של תרחיף התא המדולל בתא ספירה של נויבאואר. תחת מיקרוסקופ שדה בהיר, ספרו רק את התאים שנמצאים בארבעת הריבועים הפינתיים של התא. חישוב הממוצע ולהכפיל ב 5 × 104.הערה: ודא שיש >106 תאים להמשיך לבידוד תאים; מספר התא האופטימלי הוא 107. 7. בחירה שלילית הערה: ברירה שלילית מאפשרת למשתמשים להשיג תרבית נוירונים ראשונית טהורה על-ידי הפרדת תאים עצביים ולא-עצביים. השתמש בתמיסות מקוררות מראש. צנטריפוגה את מתלה התא ב 300 × גרם במשך 3 דקות (צנטריפוגה ניתן להאריך עד 10 דקות). שאפו בעדינות את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה לריכוז של 107 תאים ב-80 מיקרוליטר של HBSS-0.5% BSA. הוסיפו 20 μL של קוקטייל נוגדנים ביוטין של תאים לא עצביים ודגרו במשך 5 דקות ב-4°C. שטפו את התאים כדי להסיר נוגדנים חופשיים עם 2.0 מ”ל של HBSS-0.5% BSA וצנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 3 דקות. שאפו בעדינות את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-80 מיקרוליטר של HBSS-0.5% BSA. הוסיפו 20 מיקרוליטר של מיקרו-כדוריות אנטי-ביוטין, ערבבו היטב ודגרו במשך 10 דקות ב-4°C. הוסף 0.5 מ”ל של HBSS-0.5% BSA עבור עד 107 תאים והמתן עד שהעמוד המגנטי מוכן. 8. הפרדה מגנטית, בחירה שלילית הערה: הפרדה מגנטית היא שלב מכריע המאפשר הפרדה של תאים שאינם עצביים מתאי העצב. הדגימה שמכילה תאים עצביים ולא-עצביים מועברת דרך השדה המגנטי, והתאים הלא-עצביים, שקשורים לקומפלקס ביוטין-נוגדנים-חרוזים מגנטיים, לכודים בטור (איור 1C). התאים העצביים החופשיים מדוללים דרך העמודה ונאספים בצינור של 15 מ”ל. הכינו את המעמד (הכלול בערכה) עם המפריד ועמודת הטרשת הנפוצה כפי שמוצג באיור 1C. פתח את העמודה והגדר את המעמד רק כאשר התאים מוכנים להפרדה. יש לשטוף את העמוד עם 0.5 מ”ל של HBSS-0.5% BSA. המתן עד שהתמיסה תפסיק לטפטף. כדי לאסוף תאים עצביים, מניחים צינור של 15 מ”ל מתחת לעמודה ומעבירים 0.5 מ”ל של תרחיף התא דרך העמודה. לאסוף את eluate בצינור עד שהוא מפסיק לטפטף. כדי ללכוד תאים עצביים שיורית, לשטוף את עמודה 3 x 0.5 מ”ל של HBSS-0.5% BSA. כדי לאסוף תאים שאינם נוירונים, הסר את העמוד מהמגנט והנח אותו בתוך צינור חדש של 15 מ”ל. הוסף 1.0 מ”ל של HBSS–0.5% BSA לעמודה והשתמש בבוכנה כדי לאסוף את התאים הלא-עצביים המסומנים מגנטית. צנטריפוגה את התאים העצביים והלא עצביים ב 300 × גרם במשך 3 דקות. שאפו בעדינות את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-1.0 מ”ל של HBSS-0.5% BSA. ספור את התאים כפי שתואר קודם לכן בסעיף 6. במידת הצורך, צלחת את התאים שאינם עצביים בצלחת 24 באר; אחרת השליכו אותם. 9. בחירה חיובית הערה: ברגע שמתקבלת השעיה טהורה של תאי עצב, מתבצעת ברירה חיובית כדי לבודד את תאי היעד. ניתן לבודד תאים באמצעות נוגדן מצומד ביוטין ספציפי עבור אנטיגן פני השטח. הנוגדן מוכר על ידי חרוזים מגנטיים אנטי ביוטין. על ידי הזרמת תרחיף התא דרך העמודה, רק התאים המעניינים לכודים בשדה המגנטי. צנטריפוגה את תרחיף התא העצבי הטהור ב 300 × גרם במשך 3 דקות. שאפו בעדינות את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ב-80 מיקרוליטר של HBSS-0.5% BSA. יש להוסיף את הנוגדן הספציפי בהתאם להוראות היצרן ולדגור בטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות.הערה: אם מחפשים תאים המבטאים את ה-LepR, אנו מציעים נוגדן Mouse Leptin R Biotinylated (ראה טבלת חומרים) בריכוז של 0.50 מיקרוגרם/106 תאים. יש לשטוף את עודפי הנוגדן עם 2.0 מ”ל של HBSS-0.5% BSA וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 3 דקות. הסר את הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה ב 80 μL של HBSS-0.5% BSA, והוסף 20 μL של מיקרו-חרוזים אנטי-ביוטין. יש לדגור ב-4°C למשך 10 דקות. עבור כל 107 תאים, הוסף 0.5 מ”ל של HBSS-0.5% BSA והמתן עד שהעמוד המגנטי מוכן. 10. הפרדה מגנטית, בחירה חיובית הכן את המעמד עם המפריד ועמודת MS. יש לשטוף את עמודת הטרשת הנפוצה עם 0.5 מ”ל של HBSS-0.5% BSA. חכו עד שהטפטוף ייפסק. מניחים צינור של 15 מ”ל מתחת לעמודה, מעבירים 0.5 מ”ל של תרחיף התא דרך העמודה, ואוספים את האלואט המרכיב את התאים העצביים הלא ספציפיים. כדי לנקות את העמודה של תאים עצביים לא ספציפיים שיורית, לשטוף עם 3 x 0.5 מ”ל של HBSS-0.5% BSA. הסר את העמוד מהמגנט, הכנס אותו לצינור חדש של 15 מ”ל והוסף 1.0 מ”ל של HBSS-0.5% BSA. השתמש בבוכנה כדי לשטוף את תאי היעד. צנטריפוגה שני צינורות ב 300 × גרם במשך 3 דקות. הסר בעדינות את supernatant ו resuspend אותו ב 0.5 מ”ל של ציפוי בינוני. ספור את התאים כפי שתואר קודם לכן בסעיף 6. צלחת הן תאים ממוקדים כבקרה חיובית ותאים לא ספציפיים כבקרה שלילית בצפיפות של 120,000-200,000 תאים / מ”מ3 בלוח 24 בארות שהוכן קודם לכן כמתואר בסעיף 2 ודגרה ב 37 ° C ב 5% CO 2, 9% O2, ו 95% לחות במשך 12 שעות. 11. תחזוקת תרבית תאים הכינו 20 מ”ל של מדיום תרבית עם 19.2 מ”ל של מדיום תרבית עצבית, 400 מיקרוליטר של תוסף B27 (ממלאי של פי 50), 200 מיקרוליטר של גלוטמין (ממלאי של 200 מיקרומטר) ו-100 מיקרוליטר של פניצילין/סטרפטומיצין (ממלאי של פי 200). החלף את אמצעי הציפוי מ -24 צלחת באר המכילה תאים עצביים או לא עצביים. יש לשטוף עם 2 x 1.0 מ”ל של HBSS. הוסף 1.0 מ”ל של מדיה תרבותית. רענן את המדיה כל 2/3 ימים על ידי החלפת 0.5 מ”ל של מדיה ישנה עם 0.5 מ”ל של מדיה טרייה.הערה: ניתן לשמור תאים בתרבית ולהשתמש בהם עד 21 יום במבחנה (DIV21). 12. צביעת נוירון immunofluorescence 12 שעות לפני הצביעה, מכינים תמיסה המורכבת מ-50/50 מתנול ואצטון ומקררים אותה בטמפרטורה של -20°C למשך הלילה. לשטוף את הנוירונים בצלחת 24-well עם 2 x 1.0 מ”ל של 1x פוספט buffered מלוחים (PBS) במשך 5 דקות. החלף את תמיסת PBS ב- 1.0 מ”ל של תמיסת 50/50 ודגור בקרח למשך 20 דקות. יש לשטוף עם PBS אחד במשך 3 x 5 דקות. חסום את תאי העצב עם 3% BSA ב-1x PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הכן את תמיסת הנוגדנים הראשונית ב- 3% BSA ב- 1x PBS, תוך שימוש בריכוז הנוגדנים המוזכר בהוראות היצרן. הנוגדנים והריכוזים בהם נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים. החליפו את תמיסת החסימה בתמיסת הנוגדנים הראשונית ודגרו בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. שטפו את התאים במשך 3 x 10 דקות עם 1x PBS. הכינו את תמיסת הנוגדנים המשנית עם 3% BSA ב-1x PBS, תוך שימוש בריכוזי הנוגדנים בהתאם להוראות היצרן. הנוגדנים המשניים המשמשים מפורטים בטבלת החומרים. לדגור את התאים עם תמיסת נוגדנים משנית בטמפרטורת החדר במשך 1 שעות. שטפו את התאים במשך 3 x 10 דקות עם 1x PBS. השאר את הנוירונים ב 1x PBS במהלך הליך הרכבה. הניחו טיפה קטנה של אמצעי הרכבה (עם או בלי 4′,6-diamidino-2-phenylindole לזיהוי גרעיני) על שקופית המיקרוסקופ. חלצו מכסה זכוכית אחד המכיל נוירונים עם מלקחיים וטפחו על צד הכיסוי על ממחטת נייר כדי לייבש את עודפי PBS. הפוך את תלוש הכיסוי על מדיום ההרכבה, וודא שהנוירונים פונים לשקופיות המיקרוסקופ; לחץ בעדינות והסר את מדיית ההרכבה העודפת עם נייר טישו. שקופיות המיקרוסקופ מוכנות לניתוח באמצעות שדה בהיר או מיקרוסקופ קונפוקלי.