Isolatie van gerichte hypothalamus neuronen voor studies van hormonale, metabole en elektrische regulatie

OPMERKING: Een algemeen overzicht van de experimentele procedure is grafisch weergegeven in figuur 1A. Alle experimenten met muizen die in deze studie werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee (IACUC) van onze instelling. We gebruikten 3 maanden oude C57BL6 / J-muizen, die waren gehuisvest in een door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) goedgekeurde vivarium, onder de hoede van een dierenarts. De muizen leefden in grote kooien, met een licht-donkercyclus van 12 uur, en werden ad libitum gevoerd. 1. Conceptie en zwangerschapsverificatie Plaats muizen van elke achtergrond en genotype van belang voor de fokkerij. Noteer de datum en het gewicht van het vrouwtje vóór de conceptie. Inspecteer na 6 uur het vrouwtje op een plaque met een sonde. Als de plaque aanwezig is, scheid dan het vrouwtje van het mannetje. Als de plaque niet aanwezig is, houd het vrouwtje dan tot de volgende dag in de kooi en scheid de muizen vervolgens. Op dag 7, 10 en 14 na de conceptie weegt u het vrouwtje om de zwangerschap te bevestigen. 2. Media, 24-well plaat en materiaalvoorbereiding Plaats op de dag van de celisolatie kant-en-klare, met poly-D-lysine gecoate glazen afdekplaten (zie materiaaltabel) als volgt in een plaat met 24 putten:Steriliseer onder een biologische kap een enkele verpakking met 15 coverslips met 70% ethanol en laat drogen. Open de verpakking en plaats de afdekstroken in een plaat van 60 mm. Schud de plaat horizontaal om de afdekstroken te scheiden. Keer vervolgens de plaat om om enkele coverslips op te pakken om in de putten van een 24-putplaat te plaatsen. Was de coverslips één keer met 1,0 ml steriele Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) gedurende 5 min. Bereid in de tussentijd 20,0 ml plating media als volgt voor: tot 18,31 ml BME (Basal Medium Eagle, + Earle’s Salts), aangevuld met 1,0 ml warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), voeg 200 μL natriumpyruvaat (uit een 100x voorraad), 200 μL glutamine (uit een 200 nM voorraad) en 100 μL penicilline / streptomycine (uit een 200x voorraad) toe. Vervang de HBSS in de putjes door 1,0 ml platingmedia en plaats de plaat bij 37 °C in de incubator. Met behulp van een Bunsen-brander worden drie Pasteur-pipetten in afnemende diameters gepolijst. Houd de pipet met één hand vast, steek de punt in de vlam en verwijder deze snel. Herhaal het proces totdat de punt gladder wordt en de diameter is teruggebracht tot de gewenste diameter (beoordeeld met het oog). 3. Reagenspreparaat voor neurale weefseldissociatie, volgens de aanwijzingen van de neurale dissociatiekit Na het opwarmen van de digestiebuffer 1 bij kamertemperatuur, bereidt u Enzymmix 1 door 50 μL enzym 1 te mengen met 1,91 ml buffer 1 en enzymmix 2 door 15 μl enzym 2 te mengen met 30 μl digestiebuffer 2. De mixen zijn voldoende om te worden gebruikt voor het hersenweefsel van alle embryo’s. Bereid 0,5% runderserumalbumine (BSA) in HBSS, bijvoorbeeld 0,25 g in 50,0 ml HBSS. 4. Embryo-extractie Autoclaaf twee rechte fijne tangen, een gebogen punttang en een paar fijne chirurgische scharen en steriliseer ze met 70% ethanol voor gebruik. Vul vervolgens de petrischaaltjes met HBSS. Euthanaseer één E14-E16 zwangere moeder in de CO2-kamer en voer cervicale dislocatie uit.OPMERKING: De volgende stappen moeten onder steriele omstandigheden onder de motorkap worden uitgevoerd: Steriliseer de buik met 70% ethanol. Knip de buikholte open van de schaamsymfyse tot het xiphoid-proces van de ribbenkast met een chirurgische schaar en tang. Haal de baarmoederhoorn eruit en plaats deze in een plaat van 100 mm gevuld met ijskoud HBSS en was grondig. Extraheer en scheid alle embryo’s van de baarmoeder met een fijne tang. Onthoofd de embryo’s snel met een fijne chirurgische schaar en/of tang. Plaats de koppen in de 60 mm petrischaal gevuld met HBSS. 5. Hypothalamus extractie, verzameling, en weefsel dissociatie Plaats een fijne tang in de oogholte om de hersenen vast te houden. Verwijder met de andere fijne tang de huid en de schedel door te pellen totdat de hersenen zichtbaar zijn. Onderscheid de hersenen van andere weefsels op basis van het witte uiterlijk. Huid en schedel zijn roze en rijk aan vasculatuur. Verwijder de hersenen uit de schedel met behulp van de gebogen punttang en schep de hersenen uit de reukbollen en draai deze ondersteboven. Nu is de cortex ventraal en is de hypothalamus dorsaal zichtbaar op het superieure oppervlak (figuur 1B). Verwijder met de gebogen tang de laag hersenvliezen en bloedvaten totdat de hersenen er wit en helder uitzien. Met de gebogen tang scheidt u het hypothalamusgebied van de rest van de hersenen. Snijd de hypothalamus in 3-4 kleine stukjes en breng met een pipet de stukjes over in een buis van 15 ml. Herhaal de stappen voor de andere embryo’s terwijl de buis op ijs ligt. Vul de buis met 6,0 ml HBSS en laat het weefsel bezinken, verwijder het supernatant en voeg Enzym Mix 1 toe. Meng en roer de buis voorzichtig om het weefsel te voorkomen. Incubeer de buis gedurende 15 minuten in een waterbad van 37 °C en roer het weefsel om de 5 minuten om het weefsel te resuspenderen. Voeg na 15 minuten 30 μL enzymmengsel 2 toe. Dissocieer het hersenweefsel met behulp van de pipet Pasteur met de grootste diameter (<1 mm). Pipetteer 10x op en neer zonder bubbels te vormen. Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C in het waterbad. Roer de buis voorzichtig om het weefsel om de 5 minuten te resuspenderen. Voeg na 10 minuten de resterende 15 μL enzymmengsel 2 toe. Dissocieer het weefsel 10x met de andere twee vuurgepolijste pipetten met afnemende diameter, op en neer zonder belletjes te vormen. Voeg aan de buis met het gedissocieerde weefsel onmiddellijk 10,0 ml HBSS-0,5% BSA toe en centrifugeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 300 × g . Zuig het supernatant op en resuspensie de celkorrel in 1,0 ml HBS-0,5% BSA. 6. Celtelling Verdun de celsuspensie 1:5 met HBSS-0,5% BSA. Plaats 10 μL van de verdunde celsuspensie in een Neubauer-telkamer. Tel onder een brightfieldmicroscoop alleen de cellen die zich in de hoekvierkanten van de vier kamers bevinden. Bereken het gemiddelde en vermenigvuldig met 5 × 104.OPMERKING: Zorg ervoor dat er >106 cellen zijn om over te gaan tot celisolatie; Het optimale celnummer is 107. 7. Negatieve selectie OPMERKING: Negatieve selectie stelt gebruikers in staat om een zuivere primaire neuroncultuur te verkrijgen door neuronale en niet-neuronale cellen te scheiden. Gebruik voorgekoelde oplossingen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 3 minuten op 300 × g (centrifugeren kan tot 10 minuten worden verlengd). Zuig het supernatant voorzichtig aan en resuspensie van de pellet tot een concentratie van 107 cellen in 80 μL HBSS-0,5% BSA. Voeg 20 μL Non-Neuronal Cell Biotin-Antibody Cocktail toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 4 °C. Was de cellen om vrije antilichamen te verwijderen met 2,0 ml HBSS-0,5% BSA en centrifugeer gedurende 3 minuten op 300 × g . Zuig het supernatant voorzichtig aan en resuspensie van de pellet in 80 μL HBSS-0,5% BSA. Voeg 20 μL anti-biotine Microbeads toe, meng grondig en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C. Voeg 0,5 ml HBSS-0,5% BSA toe voor maximaal 107 cellen en wacht tot de magnetische kolom klaar is. 8. Magnetische scheiding, negatieve selectie OPMERKING: Magnetische scheiding is een cruciale stap die de scheiding van de niet-neuronale cellen van de neuronale cellen mogelijk maakt. Het monster met neuronale en niet-neuronale cellen wordt door het magnetisch veld geleid en de niet-neuronale cellen, die gebonden zijn aan een biotine-antilichaam-magnetisch kralencomplex, worden gevangen in de kolom (figuur 1C). De vrije neuronale cellen worden door de kolom geëlueerd en worden verzameld in een buis van 15 ml. Bereid de standaard (meegeleverd in de kit) voor met de separator en de MS-kolom zoals weergegeven in figuur 1C. Open de kolom en stel de standaard alleen in wanneer de cellen klaar zijn om te worden gescheiden. Spoel de kolom af met 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Wacht tot de oplossing stopt met druppelen. Om neuronale cellen te verzamelen, plaatst u een buis van 15 ml onder de kolom en passeert u 0,5 ml van de celsuspensie door de kolom. Verzamel het eluaat in de buis totdat het stopt met druppelen. Om resterende neuronale cellen te vangen, wast u de kolom 3 x 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Om niet-neuronale cellen te verzamelen, verwijdert u de kolom van de magneet en plaatst u deze in een nieuwe buis van 15 ml. Voeg 1,0 ml HBSS – 0,5% BSA toe aan de kolom en gebruik de zuiger om de magnetisch gelabelde niet-neuronale cellen te verzamelen. Centrifugeer de neuronale en niet-neuronale cellen op 300 × g gedurende 3 minuten. Zuig het supernatant voorzichtig op en resuspensie van de cellen in 1,0 ml HBSS-0,5% BSA. Tel de cellen zoals eerder beschreven in rubriek 6. Plaats indien nodig de niet-neuronale cellen in een 24-putplaat; gooi ze anders weg. 9. Positieve selectie OPMERKING: Zodra een zuivere neuronale celsuspensie is verkregen, wordt positieve selectie uitgevoerd om de beoogde cellen te isoleren. Cellen kunnen worden geïsoleerd door een specifiek biotine-geconjugeerd antilichaam te gebruiken voor een oppervlakteantigeen. Het antilichaam wordt herkend door anti-biotine magnetische kralen. Door de celsuspensie door de kolom te laten stromen, worden alleen de cellen van belang gevangen in het magnetisch veld. Centrifugeer de zuivere neuronale celsuspensie op 300 × g gedurende 3 minuten. Zuig het supernatant voorzichtig aan en resuspensie van de pellet in 80 μL HBSS-0,5% BSA. Voeg het specifieke antilichaam toe volgens de instructies van de fabrikant en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.OPMERKING: Als cellen die de LepR tot expressie brengen worden gezocht, stellen we een muis leptine R biotinylated antilichaam voor (zie tabel met materialen) in een concentratie van 0,50 μg / 106 cellen. Was het overtollige antilichaam af met 2,0 ml HBSS-0,5% BSA en centrifugeer gedurende 3 minuten op 300 × g . Verwijder het supernatant, resuspensie van de pellet in 80 μL HBSS-0,5% BSA en voeg 20 μL anti-biotine microbeads toe. Incubeer bij 4 °C gedurende 10 min. Voeg voor elke 107 cellen 0,5 ml HBSS-0,5% BSA toe en wacht tot de magnetische kolom klaar is. 10. Magnetische scheiding, positieve selectie Bereid de stand voor met de separator en de MS-kolom. Spoel de MS-kolom af met 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Wacht tot het druppelen stopt. Plaats een buis van 15 ml onder de kolom, passeer 0,5 ml van de celsuspensie door de kolom en verzamel het eluaat bestaande uit de niet-specifieke neuronale cellen. Om de kolom van resterende niet-specifieke neuronale cellen te reinigen, wast u met 3 x 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Verwijder de kolom van de magneet, plaats deze in een nieuwe buis van 15 ml en voeg 1,0 ml HBSS-0,5% BSA toe. Gebruik de zuiger om de beoogde cellen weg te spoelen. Centrifugeer beide buizen op 300 × g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant voorzichtig en resuspensie het in 0,5 ml platingmedium. Tel de cellen zoals eerder beschreven in rubriek 6. Plaat zowel doelcellen als de positieve controle en niet-specifieke cellen als de negatieve controle bij 120.000-200.000 cellen/mm3 dichtheid in de 24-well plaat eerder bereid zoals beschreven in sectie 2 en incubeer bij 37 °C in 5% CO 2, 9% O2 en 95% vochtigheid gedurende 12 uur. 11. Onderhoud van celkweek Bereid 20 ml kweekmedium met 19,2 ml neuronaal kweekmedium, 400 μl B27-supplement (uit een 50x-stam), 200 μl glutamine (uit een voorraad van 200 μM) en 100 μl penicilline / streptomycine (uit een voorraad van 200x). Vervang plating media van de 24 putplaat met neuronale of niet-neuronale cellen. Wassen met 2 x 1,0 ml HBSS. Voeg 1,0 ml cultuurmedia toe. Ververs de media elke 2/3 dagen door 0,5 ml oude media te vervangen door 0,5 ml verse media.OPMERKING: Cellen kunnen in cultuur worden gehouden en tot 21 dagen in vitro worden gebruikt (DIV21). 12. Neuron immunofluorescentie kleuring Bereid twaalf uur voor de kleuring een oplossing bestaande uit 50/50 methanol en aceton en koel deze een nacht af bij -20 °C. Was de neuronen in de 24-well plaat met 2 x 1,0 ml 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 5 min. Vervang de PBS-oplossing door 1,0 ml van de 50/50-oplossing en incubeer gedurende 20 minuten in ijs. Wassen met 1x PBS gedurende 3 x 5 min. Blokkeer de neuronen met 3% BSA in 1x PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Bereid de primaire antilichaamoplossing in 3% BSA in 1x PBS, met behulp van de antilichaamconcentratie die wordt vermeld in de aanwijzingen van de fabrikant. De gebruikte antilichamen en concentraties zijn opgenomen in de materiaaltabel. Vervang de blokkerende oplossing door de primaire antilichaamoplossing en incubeer ‘s nachts bij 4 °C. Was de cellen 3 x 10 min met 1x PBS. Bereid de secundaire antilichaamoplossing met 3% BSA in 1x PBS, met behulp van de concentraties van de antilichamen volgens de instructies van de fabrikant. De gebruikte secundaire antilichamen zijn opgenomen in de materiaaltabel. Incubeer de cellen met de secundaire antilichaamoplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was de cellen 3 x 10 min met 1x PBS. Laat de neuronen in 1x PBS tijdens de montageprocedure. Plaats een kleine druppel montagemedium (met of zonder 4’,6-diamidino-2-fenylindool voor nucleaire identificatie) op de microscoopglaas. Extraheer een glazen coverslip met neuronen met een tang en tik op de zijkant van de coverslip op een papieren tissue om de overtollige PBS te drogen. Draai de coverslip op het montagemedium en zorg ervoor dat de neuronen naar de microscoopglaasjes zijn gericht; Druk voorzichtig op de overtollige bevestigingsmedia en verwijder deze met tissuepapier. De microscoopglaasjes zijn klaar om geanalyseerd te worden met een brightfield of een confocale microscoop.