分离靶向下丘脑神经元，用于激素、代谢和电调节研究

注意：实验程序的一般视图如图 1A所示。本研究中对小鼠进行的所有实验均已获得我们机构的动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。我们使用3个月大的C57BL6 / J小鼠，这些小鼠在兽医的照顾下饲养在国际实验动物护理协会（AAALAC）批准的动物饲养中。小鼠生活在大笼子里，有12小时的明暗循环，并 随意喂食。 1. 受孕和怀孕验证 放置任何背景和感兴趣的基因型的小鼠进行繁殖。记录女性受孕前的日期和体重。 6小时后，用探针检查雌性斑块。如果存在斑块，请将雌性与雄性分开。如果斑块不存在，请将雌性留在笼子中直到第二天，然后将小鼠分开。 在受孕后第 7、10 和 14 天，称女性体重以确认怀孕。 2. 培养基、24 孔板和材料制备 在细胞分离当天，将即用型聚D-赖氨酸涂层玻璃盖玻片（参见 材料表）置于24孔板中，如下所示：在生物罩下，用70%乙醇对包含15个盖玻片的单个包装进行灭菌并晾干。打开包装并将盖玻片放入 60 毫米板中。水平摇动板以分离盖玻片。然后，倒置板以拾取要放置在 24 孔板孔中的单个盖玻片。 用 1.0 mL 无菌汉克平衡盐溶液 （HBSS） 洗涤盖玻片一次 5 分钟。 同时，按如下方式制备 20.0 mL 电镀培养基：向 18.31 mL BME（基础培养基鹰，+ 厄尔盐）中，加入 1.0 mL 热灭活胎牛血清 （FBS），加入 200 μL 丙酮酸钠（来自 100 倍原液）、200 μL 谷氨酰胺（来自 200 nM 原液）和 100 μL 青霉素/链霉素（来自 200 倍原液）。 用1.0mL电镀介质替换孔中的HBSS，并将板置于37°C的培养箱中。 使用本生燃烧器，对三个直径递减的巴斯德移液器进行火抛光。用一只手握住移液管，将吸头插入火焰中并快速取出。重复该过程，直到尖端变平滑并且直径减小到所需的直径（通过肉眼评估）。 3. 神经组织解离试剂盒的试剂制备，遵循神经解离试剂盒的说明 在室温下加热消化缓冲液 1 后，通过将 50 μL 酶 1 与 1.91 mL 缓冲液 1 混合来制备酶混合物 1，通过将 15 μL 酶 2 与 30 μL 消化缓冲液 2 混合来制备酶混合物 2。这些混合物足以用于所有胚胎的脑组织。 在 HBSS 中制备 0.5% 牛血清白蛋白 （BSA），例如，在 50.0 mL HBSS 中制备 0.25 g。 4. 胚胎提取 高压灭菌两个直细钳，一个弯曲点钳和一对细手术剪刀，并在使用前用70%乙醇消毒。然后，用HBSS填充培养皿。 在CO2 室中对一个E14-E16孕妇母亲实施安乐死并进行颈椎脱位。注意：必须在无菌条件下在引擎盖下执行以下步骤： 用70%乙醇对腹部进行消毒。用手术剪刀和镊子切开从耻骨联合到肋骨剑突的腹腔。 取出子宫角并将其放入装有冰冷HBSS的100毫米板中并彻底清洗。 用细镊子从子宫中提取并分离所有胚胎。用精细的手术剪刀和/或镊子快速斩首胚胎。将头部放入装有HBSS的60毫米培养皿中。 5.下丘脑提取、采集和组织解离 将一个细镊子放在眼腔中以固定大脑。使用其他细镊子，通过剥离去除皮肤和头骨，直到大脑可见。根据其白色外观将大脑与其他组织区分开来。皮肤和头骨是粉红色的，血管系统丰富。 使用弯曲的点镊子从头骨中取出大脑，然后从嗅球中舀出大脑，将其倒置。 现在皮层是腹侧的，下丘脑在上表面的背侧可见（图1B）。用弯曲的镊子去除脑膜和血管层，直到大脑看起来白色和清晰。 用弯曲的镊子将下丘脑区域与大脑的其余部分分开。 将下丘脑切成 3-4 小块，用移液管将这些碎片转移到 15 mL 管中。 当管子在冰上时，对其他胚胎重复这些步骤。 用 6.0 mL HBSS 填充试管，让组织沉淀，除去上清液，加入酶混合物 1。轻轻混合并搅拌管以防止组织。 将管在37°C水浴中孵育15分钟，每5分钟搅拌一次组织以重悬组织。 15 分钟后，加入 30 μL 酶混合物 2。使用最大直径（<1毫米）的移液器巴斯德解离脑组织。上下移液 10 倍，不形成气泡。 在水浴中于37°C孵育10分钟。轻轻搅拌试管以每5分钟重悬一次组织。 10 分钟后，加入剩余的 15 μL 酶混合物 2。将组织与其他两个直径减小的火抛光移液器分离 10 倍，上下不形成气泡。 向具有解离组织的管中，立即加入10.0mL的HBSS-0.5%BSA，并在室温下以300× g 离心10分钟。 吸出上清液并将细胞沉淀重悬于1.0mL HBS-0.5%BSA中。 6. 细胞计数 使用HBSS-0.5%BSA以1：5稀释细胞悬液。 将 10 μL 稀释的细胞悬液放入 Neubauer 计数室中。 在明场显微镜下，仅计数四个腔室角方块中的细胞。计算平均值并乘以 5 × 104。注意：确保有>106 个细胞进行细胞分离;最佳细胞数为 107。 7. 否定选择 注意：阴性选择使用户能够通过分离神经元和非神经元细胞获得纯原代神经元培养物。使用预冷溶液。 将细胞悬液以300× g 离心3分钟（离心可延长至10分钟）。轻轻吸出上清液并将沉淀重悬至80μLHBSS-0.5%BSA中的107 个细胞的浓度。 加入20μL非神经元细胞生物素抗体混合物，并在4°C下孵育5分钟。 用 2.0 mL HBSS-0.5% BSA 洗涤细胞以去除游离抗体，并以 300 × g 离心 3 分钟。 轻轻吸出上清液并将沉淀重悬于80μLHBSS-0.5%BSA中。加入20μL抗生物素微珠，充分混合，并在4°C下孵育10分钟。 加入 0.5 mL HBSS-0.5% BSA 至多 10 个7 个 细胞，并等待磁柱准备就绪。 8.磁选，负选择 注意：磁分离是允许将非神经元细胞与神经元细胞分离的关键步骤。含有神经元和非神经元细胞的样品通过磁场，与生物素-抗体-磁珠复合物结合的非神经元细胞被捕获在色谱柱中（图1C）。游离神经元细胞通过色谱柱洗脱并收集在15 mL管中。 使用分离器和MS色谱柱准备支架（包含在套件中），如图 1C所示。 仅当细胞准备好分离时，才打开色谱柱并设置支架。 用0.5 mL HBSS-0.5%BSA冲洗色谱柱。等到溶液停止滴落。 要收集神经元细胞，请将15 mL管放在色谱柱下方，并将0.5 mL的细胞悬液通过色谱柱。将洗脱液收集在管中，直到它停止滴落。为了捕获残留的神经元细胞，洗涤色谱柱3 x 0.5 mL的HBSS-0.5%BSA。 要收集非神经元细胞，请从磁铁上取下柱并将其放入新的15ml管中。向色谱柱中加入1.0 mL HBSS–0.5%BSA，并使用柱塞收集磁性标记的非神经元细胞。 将神经元和非神经元细胞以300× g 离心3分钟。轻轻吸出上清液并将细胞重悬于1.0mL的HBSS-0.5%BSA中。按照前面第 6 节中所述对细胞进行计数。 如果需要，将非神经元细胞接种在 24 孔板中;否则丢弃它们。 9. 正向选择 注意：一旦获得纯神经元细胞悬液，就会进行正向选择以分离目标细胞。可以通过使用针对表面抗原的特定生物素偶联抗体来分离细胞。该抗体被抗生物素磁珠识别。通过将细胞悬液流过色谱柱，只有感兴趣的细胞被困在磁场中。 将纯神经元细胞悬液以300× g 离心3分钟。轻轻吸出上清液并将沉淀重悬于80μLHBSS-0.5%BSA中。按照制造商的说明添加特异性抗体，并在4°C下孵育10分钟。注意：如果寻求表达LepR的细胞，我们建议使用浓度为0.50μg/ 106细胞的小鼠瘦素R生物素化抗体（参见材料表）。 用 2.0 mL HBSS-0.5% BSA 洗去多余的抗体，并以 300 × g 离心 3 分钟。 除去上清液，将沉淀重悬于 80 μL HBSS-0.5% BSA 中，并加入 20 μL 抗生物素微珠。在4°C孵育10分钟。 对于每 10 个7 个 细胞，加入 0.5 mL HBSS-0.5% BSA，并等待磁柱准备就绪。 10.磁选，正向选择 准备带有分离器和MS柱的支架。用 0.5 mL HBSS-0.5% BSA 冲洗 MS 色谱柱。等到滴水停止。 将 15 mL 管置于色谱柱下方，将 0.5 mL 细胞悬液通过色谱柱，并收集包含非特异性神经元细胞的洗脱液。要清洁残留的非特异性神经元细胞柱，请用3 x 0.5 mL HBSS-0.5%BSA洗涤。 从磁铁上取下色谱柱，将其放入新的 15 mL 管中，然后加入 1.0 mL HBSS-0.5% BSA。使用柱塞冲洗掉目标细胞。 将两个管以300 ×g 离心3分钟。轻轻除去上清液并将其重悬于0.5mL电镀介质中。 按照前面第 6 节中所述对细胞进行计数。 将靶向细胞作为阳性对照，非特异性细胞作为阴性对照，在先前如第2节所述制备的24孔板中以120,000-200,000细胞/mm 3密度接种，并在37°C下在5%CO 2,9%O2和95%湿度下孵育12小时。 11. 细胞培养维护 用 19.2 mL 神经元培养基、400 μL B27 补充剂（来自 50 倍原液）、200 μL 谷氨酰胺（来自 200 μM 原液）和 100 μL 青霉素/链霉素（来自 200 倍原液）制备 20 mL 培养基。 更换含有神经元或非神经元细胞的24孔板中的电镀介质。 用 2 x 1.0 mL HBSS 洗涤。 加入 1.0 mL 培养基。 每 2/3 天刷新一次培养基，用 0.5 mL 新培养基替换 0.5 mL 旧培养基。注意：细胞可以在培养物中保持，并在 体外 使用长达21天（DIV21）。 12. 神经元免疫荧光染色 染色前12小时，制备由50/50甲醇和丙酮组成的溶液，并在-20°C下冷却过夜。 用 2 x 1.0 mL 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤 24 孔板中的神经元 5 分钟。 用 1.0 mL 的 50/50 溶液替换 PBS 溶液，并在冰中孵育 20 分钟。 用 1x PBS 清洗 3 x 5 分钟。 在室温下用3%BSA在1x PBS中阻断神经元1小时。 使用制造商说明中提到的抗体浓度，在 1x PBS 中制备 3% BSA 中的一抗溶液。使用的抗体和浓度列在 材料表中。 用一抗溶液替换封闭溶液，并在4°C孵育过夜。 用1x PBS洗涤细胞3 x 10分钟。 按照制造商的说明使用抗体浓度在1x PBS中用3%BSA制备二抗溶液。使用的二抗列在 材料表中。 将细胞与二抗溶液在室温下孵育1小时。 用1x PBS洗涤细胞3 x 10分钟。 在安装过程中将神经元留在 1x PBS 中。在显微镜载玻片上放置一小滴封片剂（有或没有4’，6-二脒基-2-苯基吲哚用于核鉴定）。用镊子提取一个含有神经元的玻璃盖玻片，并在纸巾上敲击盖玻片的侧面以干燥多余的PBS。翻转封片介质上的盖玻片，确保神经元面向显微镜载玻片;用薄纸轻轻按压并取出多余的封片剂。 显微镜载玻片已准备好用明场或共聚焦显微镜进行分析。