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Abstract
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Imunologia e Infecção

중화 분석을 통해 SARS-CoV-2에 대한 체액성 면역 반응을 모니터링하기 위한 분자 도구로서의 유사형 바이러스

Published: November 21, 2023
doi:
10.3791/65658
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1Department of Neuroscience, Biomedicine and Movement,University of Verona, 2Laboratory of Molecular Neurovirology, Faculty of Health Science,University of Brasília, 3Viral Pseudotype Unit, Medway School of Pharmacy,Universities of Kent and Greenwich at Medway

Summary

유사형 바이러스(PV)는 실제 바이러스를 취급하는 것보다 더 안전한 조건에서 숙주-바이러스 상호 작용을 연구하는 데 사용되는 복제 결함 바이러스입니다. 여기에 제시된 자세한 프로토콜은 SARS-CoV-2 PV를 사용하여 COVID-19 백신 접종 후 환자 혈청의 중화 능력을 테스트하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

유사형 바이러스(PV)는 관심 유전자 전달을 위한 유전자 치료에 더 잘 알려진 용도 외에도 숙주-바이러스 상호 작용을 연구하고 혈청 샘플의 중화 능력을 테스트하는 데 사용할 수 있는 분자 도구입니다. PV는 바이러스 게놈이 PV에 통합되지 않은 서로 다른 플라스미드로 나뉘기 때문에 복제 결함이 있습니다. 이 안전하고 다재다능한 시스템을 통해 생물 안전 레벨 2 실험실에서 PV를 사용할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 여기에 언급된 바와 같이 3개의 플라스미드를 기반으로 렌티바이러스 PV를 생산하기 위한 일반적인 방법론을 제시한다: (1) 감염을 모니터링하는 데 필요한 리포터 유전자를 운반하는 백본 플라스미드; (2) PV를 생성하는 데 필요한 모든 구조 단백질에 대한 유전자를 운반하는 패키징 플라스미드; (3) 바이러스 tropism을 결정하고 숙주 세포로의 바이러스 진입을 매개하는 envelope surface glycoprotein 발현 플라스미드. 이 연구에서 SARS-CoV-2 스파이크는 비복제성 SARS-CoV-2 유사형 렌티바이러스 생산에 사용되는 외피 당단백질입니다.

간단히 말해서, 패키징 셀(HEK293T)은 표준 방법을 사용하여 3개의 서로 다른 플라스미드와 co-transfection되었습니다. 48시간 후, PV를 함유하는 상층액을 수거, 여과하고, -80°C에서 보관하였다. SARS-CoV-2 PV의 감염성은 감염 후 48시간 후 표적 세포주에서 리포터 유전자(루시페라아제)의 발현을 연구하여 테스트되었습니다. 상대 발광 단위(RLU) 값이 높을수록 감염/전달률이 높아집니다. 또한, 감염성 PV를 연속적으로 희석된 혈청 샘플에 첨가하여 유사 바이러스가 표적 세포에 진입하는 중화 과정을 연구했으며, RLU 강도의 감소로 측정되었습니다: 높은 중화 활성에 해당하는 낮은 값.

Introduction

유사형 바이러스(PV)는 숙주-바이러스 및 병원체-병원체 상호 작용을 연구하기 위해 미생물학에서 사용되는 분자 도구입니다 1,2,3,4. PV는 바이러스 게놈을 보호하는 바이러스 코어인 내부 부분과 트로피즘을 정의하는 바이러스 표면의 외피 당단백질인 외부 부분으로 구성된다5. 유사 바이러스는 새로운 바이러스 입자를 생성하기 위한 모든 유전 정보를 포함하지 않기 때문에 표적 세포에서 복제가 불가능합니다. 이러한 특이한 특징의 조합으로 인해 PV는 야생형 바이러스에 대한 안전한 대안이 될 수 있습니다. 반면에 야생형 바이러스는 병원성이 높아 BSL 2 실험실에서 분석을 위해 사용할 수 없다6.

PV의 감염성은 일반적으로 형광 단백질(GFP, RFP, YFP) 또는 화학발광 산물(루시페라아제)을 생산하는 효소를 코딩하는 리포터 유전자에 의해 모니터링될 수 있습니다. 이것은 PV 생산에 사용되는 플라스미드 중 하나에 포함되어 있으며 유사 바이러스7의 게놈에 통합됩니다.

현재 HIV-1 게놈을 기반으로 하는 렌티바이러스 유래 입자를 포함하여 여러 유형의 PV 코어가 존재합니다. 다른 플랫폼에 비해 HIV-1 기반 PV의 가장 큰 장점은 표적 세포 게놈8에 내재된 통합 프로세스입니다. HIV-1은 전염성이 매우 높은 바이러스이고 AIDS의 원인균이지만, 이러한 렌티바이러스 벡터는 수년에 걸친 광범위한 최적화 단계 덕분에 안전하게 사용할 수 있습니다. 형질도입 능력에 영향을 주지 않으면서 바이러스 유전자가 고갈된 2세대 렌티바이러스 벡터의 도입으로 최적의 안전성 조건이 달성되었다9. 3세대 및 4세대는 바이러스 게놈을 별도의 플라스미드10,11로 추가로 분할하여 렌티바이러스 벡터 처리의 안전성을 높이는 데 기여했습니다. 최신 세대의 PV는 일반적으로 유전자 치료를 위한 렌티바이러스 벡터를 생산하는 데 사용됩니다.

PV는 생산 및 감염 단계에서 바이러스와 숙주 세포 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. PV는 특히 유사 바이러스 중화 분석(PVNA)에 사용됩니다. PVNA는 PV의 외피12,13에 있는 바이러스 당단백질을 표적으로 하여 혈청 또는 혈장의 중화 가능성을 평가하도록 널리 검증되었습니다. 억제 농도(50, IC50)로 표현되는 중화 활성은 바이러스 입자 진입의 50%를 차단하는 혈청/혈장의 희석으로 정의된다14. 이 프로토콜에서는 부스터 백신 접종을 받기 전후에 수집된 혈청에서 중증 급성 호흡기 증후군 – 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)에 대한 항체 활성을 테스트하기 위한 PVNA 설정에 대해 설명했습니다.

Protocol

본 의정서는 베로나 대학교 윤리 위원회(승인 의정서 번호 1538)의 승인을 받았으며 지침을 따릅니다. 연구에 참여한 인간 피험자로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻었습니다. 전혈 샘플은 항 SARS-CoV-2 백신을 접종하는 과정에 있는 의료 종사자(HCW) 자원 봉사자로부터 수집되었습니다. 이들 샘플은 혈청15의 후속 분리를 위해 항응고제를 함유하는 플라스틱 튜브에서 수집하였다.<…

Representative Results

이 프로토콜은 SARS-CoV-2 PV의 생산 및 항COVID-19 백신 접종을 받는 피험자의 혈청/혈장의 중화 활성을 분석하기 위한 이러한 PV의 다운스트림 적용에 대해 설명합니다17. 또한 이 프로토콜은 중화 반응의 진화를 테스트하기 위해 각 SARS-CoV-2 우려 변이체(VOC)의 유사형을 생성하는 데 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 COVID-19 백신 접종 후 체액성 면역 반응에 대한 연구를 용이하게 함?…

Discussion

야생형 바이러스를 사용하면 실제 감염을 시뮬레이션할 수 있지만, 렌티바이러스 PV는 병원성 바이러스를 다루는 데 필요한 엄격한 안전 요건 없이 바이러스 유입 및 감염과 관련된 메커니즘을 연구하는 데 더 안전한 옵션입니다 4,20,21. PV는 연구의 목적인 병원성 바이러스의 표면 외피 당단백질로 둘러싸인 복제 결함 바이러?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 의료 종사자 자원 봉사자들의 기여를 인정합니다. 이 프로젝트는 이탈리아 MUR의 Department of Excellence 2023/2027에서 지원했습니다. AR과 DZ는 PRIN2022(EU 자금 지원; NextGenerationEU)를 참조하십시오

Materials

0.45 μm filter SARSTEDT 83 1826
6-well plate SARSTEDT 83 3920
96-well plate SARSTEDT 8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merck 10403892
Black Opaque 96-well Microplate Perkin Elmer 60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium  SIGMA-ALDRICH D6546 – 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) AUROGENE AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum AUROGENE AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7 graphpad dotmatics NA In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells ATCC CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells ATCC CRL-3216 HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine  AUROGENE AU-X0550-100
Luminometer – Victor3 Perkin Elmer HH35000500 In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer' 
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 11058021 In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' 
p8.91 packaging plasmid Di Genova et al., 2021 A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid Di Genova et al., 2021 A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin AUROGENE AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) SIGMA-ALDRICH 408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) Addgene 145839 This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid Addgene pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System Perkin Elmer 6066759 In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x AUROGENE AU-L0949-100
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Referências

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Pseudotyped VirusesSARS-CoV-2Neutralization AssayMolecular ToolHost-virus InteractionsGene TherapyLentiviralPackaging CellsReporter GeneInfectivityRelative Luminescence Units

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Fantoni, T., Bissoli, M., Stefani, C., Voi, M., Dabija, A., Casula, R., Minafra, D. L., da Fonseca Palmeira, J., Argañaraz, E. R., Mayora-Neto, M., Temperton, N. J., Zipeto, D., Ruggiero, A. Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay. J. Vis. Exp. (201), e65658, doi:10.3791/65658 (2023).
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