JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

نموذج استنزاف ورم خبيث في العقدة الليمفاوية لتقييم ديناميكيات الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد أثناء تكوين الورم

Published: January 26, 2024
doi:
10.3791/65646
, , , , , , , , , , , , ,
1College of Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University, 2Institute of Immunology,Third Military Medical University, 3Institute of Cancer, Xinqiao Hospital,Third Military Medical University, 4Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, 5Institute of life science,Chongqing Medical University

Summary

يوفر التصميم التجريبي المعروض هنا نموذجا تناسليا مفيدا لدراسات الخلايا التائية CD8+ الخاصة بمولد الضد أثناء ورم خبيث في العقدة الليمفاوية (LN) ، والذي يستبعد اضطراب خلايا CD8+ T المتارة.

Abstract

تكتسب الخلايا التائية CD8 + T الخاصة بمستضد الورم من تصريف الغدد الليمفاوية أهمية متراكمة في تصاعد الاستجابة المناعية المضادة للورم أثناء تكوين الأورام. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، تشكل الخلايا السرطانية مواضع نقيلية في الغدد الليمفاوية قبل أن تنتقل إلى أعضاء بعيدة. إلى أي مدى تأثرت استجابات الخلايا التائية CD8 + المحلية والمنهجية بورم خبيث LN لا يزال غامضا. تحقيقا لهذه الغاية ، أنشأنا نموذج ورم خبيث LN الفئران جنبا إلى جنب مع خط خلايا سرطان الجلد B16F10-GP الذي يعبر عن المستضد الجديد البديل المشتق من فيروس التهاب المشيمية اللمفاوي (LCMV) ، والبروتين السكري (GP) ، والفئران المعدلة وراثيا P14 التي تؤوي مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) الخاصة بالببتيد المشتق من GP GP33-41 المقدم من جزيء معقد التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الأولى (MHC) H-2Db. يتيح هذا البروتوكول دراسة استجابات الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد أثناء ورم خبيث LN. في هذا البروتوكول ، تم زرع الفئران C57BL / 6J تحت الجلد بخلايا B16F10-GP ، تليها النقل بالتبني بخلايا P14 الساذجة. عندما نما الورم تحت الجلد إلى قطر 5 مم تقريبا ، تم استئصال الورم الرئيسي ، وتم حقن خلايا B16F10-GP مباشرة في العقدة الليمفاوية التي تستنزف الورم (TdLN). بعد ذلك ، تمت مراقبة ديناميكيات الخلايا التائية CD8 + أثناء عملية ورم خبيث LN. بشكل جماعي ، قدم هذا النموذج نهجا للتحقيق بدقة في الاستجابات المناعية للخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد أثناء ورم خبيث LN.

Introduction

أحدث العلاج المناعي للسرطان ، وخاصة حصار نقاط التفتيش المناعية (ICB) ، ثورة في علاج السرطان1. يمنع ICB المستقبلات المناعية المثبطة (مثل PD-1 و Tim-3 و LAG-3 و TIGIT) ، والتي يتم التعبير عنها بشكل كبير في خلايا CD8 + T المنهكة في البيئة المكروية للورم (TME) ، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا التائية CD8 + T المنهكة2. بالنظر إلى عدم تجانس خلايا CD8 + T المستنفدة ، كشفت الأدلة المتراكمة أن خلايا CD8 + T الخاصة بالورم المشتقة من المحيط ، بما في ذلك تصريف العقدة الليمفاوية (dLN) ، ولكن ليس في TME ، تتوسط في فعالية ICB3،4،5،6،7،8. في الآونة الأخيرة ، تم تأكيد أن الخلايا التائية CD8 + T المشتقة من TdLN المشتقة من TCF-1 + TOX (TdLN-TTSM) هي المستجيبون الحقيقيون ل ICB التي تجسد العديد من الخصائص الوظيفية للخلايا التائية للذاكرة التقليدية ويمكن أن تتوسع وتتمايز إلى خلايا مستنفدة من ذرية عند علاج ICB9. إجمالا ، أكدت هذه النتائج أهمية LN في بناء مناعة مضادة للورم.

تعمل العقدة الليمفاوية كمكان حاسم في تسهيل تحضير وتنشيط خلايا CD8 + T الخاصة بالورم من خلال توفير الأساس الهيكلي وكذلك الإشارات البيولوجية10. تقوم عدة أنواع من الخلايا السرطانية في كثير من الأحيان بزرع العقدة الليمفاوية الخافرة (SLN ، أول LN يستنزف ورما أوليا) قبل النشر المنهجي11. يرتبط وجود ورم خبيث SLN بنتائج سيئة في سرطان الإنسان وأظهرت النماذج قبل السريرية أن الخلايا السرطانية في TdLN يمكن أن تنتشر إلى أعضاء بعيدة من خلال كل من الأوعية اللمفاوية والأوعية الدموية للعقدة12،13،14،15. تمثل خزعة SLN الآن إجراء قياسيا لتوجيه قرارات العلاج اللاحقة في العديد من أنواع الأورام الصلبة التي يمكن أن تتجنب الاستئصال غير الضروري ل LN16,17 غير المتورط. حتى بالنسبة إلى LN المعنية ، لا يزال من المثير للجدل ما إذا كانت هناك حاجة إلى الاستئصال الجراحي ومتى حيث أظهرت العديد من الدراسات أن إزالة LN الإقليمية لم تظهر تحسنا في البقاء على قيد الحياة بشكل عام مقارنة بأولئك الذين تلقوا العلاج الإشعاعي أو الجهازي دون استئصال LN الإقليمي18,19. أحد التفسيرات هو أن LN النقيلي (mLN) المصاب بمرض مجهري قد يحتفظ ببعض القدرة على تثقيف الخلايا المناعية وتوفير بعض الفوائد العلاجية. لذلك ، من المهم للغاية توضيح كيفية تأثير ورم خبيث LN على الاستجابة المناعية المضادة للورم ، وخاصة خصائص ووظائف TdLN-TTSM.

حتى الآن ، كشفت كل من البيانات قبل السريرية والسريرية عن بعض التغييرات الهيكلية والخلوية في mLN20. ومع ذلك ، لم يتم تحديد التغييرات الديناميكية لخلايا CD8 + T الخاصة بالورم أثناء ورم خبيث LN. لذلك ، هناك حاجة إلى تطوير نموذج مقنع لورم خبيث LN لمزيد من التحقيق. في الواقع ، أبلغت العديد من الدراسات عن نماذج ماوس mLN بطرق مختلفة14،21،22. على سبيل المثال ، تم إجراء ورم خبيث عفوي في LNs الإبطية من خلال زرع خلايا سرطان الثدي 4T1 في وسادة الدهون الثديية22. في دراسة أخرى ، قام Reticker-Flynn et al. بتوليد خطوط خلايا سرطان الجلد مع ارتفاع معدل الانتشار من الورم الأولي تحت الجلد إلى LNs من خلال التلقيح التسلسلي للخلايا السرطانية المزروعة من أنسجة mLN المنفصلة (تسع جولات) 14. تم إعداد نموذج آخر شائع الاستخدام عن طريق حقن الخلايا السرطانية في وسادة القدم وسيتم تشكيل المواضع النقيلي في LN22 المأبضي. والجدير بالذكر أنه من الصعب تقييم النقاط الزمنية الدقيقة للتدخل لأن ورم خبيث LN في هذه النماذج ليس دائما مخلصا.

في هذه الدراسة ، تم إنشاء نموذج نقيلي LN للفأر من خلال الحقن داخل العقد لخلايا B16F10-GP23,24 ، الناتجة عن الإدخال بوساطة CRISPR / Cas9 لتسلسل جين البروتين السكري لفيروس LCMV (GP) في جينوم خط خلية B16F109. بعد ذلك ، تم نقل هذه الفئران بخلايا P14 التي تؤوي مستقبلات الخلايا التائية المعدلة وراثيا (TCRs) على وجه التحديد على H-2Db GP33-41 25,26 ويمكن التحقيق في الديناميات النظامية والمحلية لخلايا CD8 + T الخاصة بالمستضد أثناء ورم خبيث LN. يوفر تصميمنا التجريبي نموذجا مفيدا لدراسة الاستجابات المناعية ، وخاصة الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد أثناء ورم خبيث LN والذي يستبعد اضطراب خلايا CD8 + T المتارة. ستؤثر هذه النتائج على خيارات العلاج السريري حول إزالة mLN أو الاحتفاظ به وإلقاء ضوء جديد على التلاعب ب mLN لتحقيق أقصى قدر من الفوائد العلاجية.

Protocol

كانت الفئران C57BL / 6J (المشار إليها بالفئران B6) والفئران المعدلة وراثيا P14 الساذجة 9,27 المستخدمة من 6 إلى 10 أسابيع من العمر تزن 18-22 جم. تم تضمين كل من الذكور والإناث دون عشوائية أو تعمية. أجريت جميع الدراسات على وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخد…

Representative Results

يظهر الرسم التخطيطي لهذا التصميم التجريبي في الشكل 1 أ. تم زرع ما مجموعه 5 × 105 خلايا B16F10-GP في 100 ميكرولتر من PBS تحت الجلد (s.c.) في المنطقة الأربية الثنائية للفئران CD45.2 C57BL / 6J. بعد 7 أيام ، تم حقن هذه الفئران الحاملة للورم داخل الصفاق (i.p.) ب 4 ملغ CTX ، تليها النقل بالتبني لخلايا …

Discussion

أثناء تكوين الورم ، تبتلع الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) مستضدات الورم وتهاجر إلى TdLN حيث تقوم بتجهيز خلايا CD8 + T. بعد التحضير والتنشيط ، تترك خلايا CD8 + T TdLN وتتسلل إلى الورم لقتل الخلايا السرطانية10. من خلال استئصال TdLN وإدارة FTY720 التي تمنع خروج الخلايا المناعية من الأعض?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم للعلماء الشباب المتميزين في الصين (رقم 82122028 إلى LX) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82173094 إلى LX) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في تشونغ تشينغ (رقم 2023NSCQ-BHX0087 إلى SW).

Materials

1.5 mL centrifuge tube KIRGEN KG2211
100 U insulin syringe BD Biosciences  320310
15 mL conical tube  BEAVER  43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)  Sigma  T48402-25G 
2-Methyl-2-butanol Sigma 240486-100ML 
70 μm nylon cell strainer BD Falcon  352350
APC anti-mouse CD45.1  BioLegend  110714 Clone:A20 
B16-GP cell line Beijing Biocytogen Co.Ltd, China Custom
BSA-V (bovine serum albumin)  Bioss bs-0292P
cell culture dish BEAVER  43701/43702/43703 
centrifuge Eppendorf 5810R-A462/5424R 
cyclophosphamide Sigma  C0768-25G 
Cyclophosphamide (CTX) Sigma PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium  Gibco  C11995500BT 
EDTA Sigma EDS-500g 
FACS tubes BD Falcon 352052
fetal bovine serum  Gibco 10270-106
flow cytometer BD FACSCanto II
hemocytometer PorLab Scientific HM330
isoflurane RWD life science  R510-22-16 
KHCO3  Sangon Biotech  A501195-0500 
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation  Life Technologies  L10199 
needle carrier  RWD Life Science  F31034-14 
NH4Cl  Sangon Biotech A501569-0500 
paraformaldehyde Beyotime P0099-500ml 
PE anti-mouse TCR Vα2 BioLegend 127808 Clone:B20.1 
Pen Strep Glutamine (100x) Gibco 10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a  BioLegend 100734 Clone:53-6.7
RPMI-1640 Sigma R8758-500ML
sodium azide Sigma S2002 
surgical forceps RWD Life Science  F12005-10
surgical scissors RWD Life Science  S12003-09 
suture thread RWD Life Science F34004-30 
trypsin-EDTA Sigma T4049-100ml
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
  2. Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
  3. Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
  4. Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
  5. Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
  6. Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
  7. Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
  8. Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
  9. Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
  10. Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
  11. Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124 (3), 922-928 (2014).
  12. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  13. Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
  14. Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
  15. Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
  16. Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
  17. Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
  18. Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
  19. Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
  20. du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
  21. An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
  22. Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
  23. Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
  24. Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
  25. Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
  26. Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
  27. Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
  28. North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
  29. Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
  30. Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
  31. Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
  32. Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
  33. Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
  34. Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
  35. Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
  36. Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).

Tags

Lymph Node MetastasisAntigen-specific CD8+ T CellsTumor MicroenvironmentTumor-draining Lymph NodesImmune Checkpoint Blockade TherapyMelanomaLCMV GlycoproteinP14 Transgenic Mice

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Zhang, Y., Su, X., Wang, L., Yue, Z., Liu, Q., Ran, L., Lei, S., Hu, J., Xu, L., Ye, L., Ji, P., Li, G., Huang, Q., Wen, S. Draining Lymph Node Metastasis Model for Assessing the Dynamics of Antigen-Specific CD8+ T Cells During Tumorigenesis. J. Vis. Exp. (203), e65646, doi:10.3791/65646 (2024).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image