ईईजी रिकॉर्डिंग के दौरान चूहों में पार्श्व पूंछ नस से मस्तिष्कमेरु द्रव और रक्त का नमूना
Summary
प्रोटोकॉल निरंतर वीडियो-इलेक्ट्रोएन्सेफलोग्राम (ईईजी) निगरानी के साथ समानांतर में प्रदर्शन किए गए मिर्गी चूहों से बार-बार मस्तिष्कमेरु द्रव और रक्त संग्रह दिखाता है। ये शरीर के विभिन्न द्रव अणुओं और जब्ती गतिविधि में परिवर्तन के बीच संभावित लिंक की खोज के लिए सहायक हैं।
Abstract
क्योंकि शरीर के तरल पदार्थ की संरचना कई शारीरिक और रोग गतिशीलता को दर्शाती है, जैविक तरल नमूने आमतौर पर ब्याज के अणुओं को मापने के लिए कई प्रयोगात्मक संदर्भों में प्राप्त किए जाते हैं, जैसे हार्मोन, विकास कारक, प्रोटीन या छोटे गैर-कोडिंग आरएनए। एक विशिष्ट उदाहरण मिर्गी के लिए बायोमार्कर के शोध में जैविक तरल पदार्थों का नमूना है। इन अध्ययनों में, मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) और प्लाज्मा में अणुओं के स्तर की तुलना करना वांछनीय है, समानांतर में सीएसएफ और प्लाज्मा को वापस लेना और नमूने से और दौरे की समय दूरी पर विचार करना। संयुक्त सीएसएफ और प्लाज्मा नमूनाकरण, मिर्गी के जानवरों में वीडियो-ईईजी निगरानी के साथ मिलकर, ख्यात नैदानिक और रोगनिरोधी बायोमार्कर के सत्यापन के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है। यहां, सिस्टर्न मैग्ना से संयुक्त सीएसएफ वापसी की एक प्रक्रिया और मिर्गी के चूहों में पार्श्व पूंछ नस से रक्त का नमूना जो लगातार वीडियो-ईईजी निगरानी कर रहे हैं, का वर्णन किया गया है। यह प्रक्रिया आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली अन्य तकनीकों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करती है। यह कम से कम दर्द या आक्रामकता, और संज्ञाहरण के कम समय के साथ तेजी से नमूने की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, इसका उपयोग टीथर्ड और टेलीमेट्री ईईजी रिकॉर्ड किए गए चूहों दोनों में सीएसएफ और प्लाज्मा नमूने प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, और इसका उपयोग प्रयोग के कई दिनों में बार-बार किया जा सकता है। आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया को छोटा करके नमूने के कारण तनाव को कम करके, उपायों से बायोफ्लुइड में जांच किए गए अणुओं के सही स्तर को अधिक सटीक रूप से प्रतिबिंबित करने की उम्मीद है। एक उपयुक्त विश्लेषणात्मक परख की उपलब्धता के आधार पर, इस तकनीक का उपयोग एक ही समय में ईईजी रिकॉर्डिंग करते समय कई, विभिन्न अणुओं के स्तर को मापने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) और रक्त नमूना मिर्गी के बायोमार्कर की पहचान करने और मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, दोनों प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अनुसंधान 1,2 में। आजकल, मिर्गी का निदान और मिर्गी बायोमार्कर पर अधिकांश शोध ईईजी और न्यूरोइमेजिंग 3,4,5 पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालाँकि, ये दृष्टिकोण कई सीमाएँ प्रस्तुत करते हैं। नियमित खोपड़ी माप के अलावा, कई मामलों में, ईईजी को गहराई इलेक्ट्रोड6 जैसी आक्रामक तकनीकों की आवश्यकता होती है। मस्तिष्क इमेजिंग विधियों में खराब अस्थायी और स्थानिक संकल्प होते हैं और अपेक्षाकृत महंगे और समय लेने वाले 7,8 होते हैं। इस कारण से, गैर-आक्रामक, कम लागत वाली और बायोफ्लुइड-आधारित बायोमार्कर की पहचान एक बहुत ही आकर्षक विकल्प प्रदान करेगी। इसके अलावा, इन बायोफ्लुइड बायोमार्कर को उनकी भविष्यवाणी को तेज करने के लिए उपलब्ध नैदानिक दृष्टिकोणों के साथ जोड़ा जा सकता है।
मिर्गी के साथ का निदान रोगियों नियमित रूप से ईईजी 9,10 और रक्त नमूना 11,12,13,14 के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं, और कई भी सीएसएफ वापसी के लिए जीवन के लिए खतरा कारणों (यानी, तीव्र संक्रमण, autoimmune एन्सेफलाइटिस) 15 को बाहर करने के लिए. इन रक्त और सीएसएफ नमूनों का उपयोग नैदानिक अनुसंधान में किया जा सकता है जिसका उद्देश्य मिर्गी के लिए बायोमार्कर की पहचान करना है। उदाहरण के लिए, हॉग और सहकर्मियों ने पाया है कि तीन प्लाज्मा टीआरएनए टुकड़ों में वृद्धि मानव मिर्गी1 4 में जब्ती की घटना से पहले होती है। इसी तरह, मानव सीएसएफ और सीरम में इंटरल्यूकिन -1 बीटा (आईएल -1β) स्तर, सीरम पर सीएसएफ में आईएल-1β के अनुपात के रूप में व्यक्त किया गया, दर्दनाक मस्तिष्ककी चोट 16 के बाद अभिघातजन्य मिर्गी के विकास की भविष्यवाणी कर सकते हैं. ये अध्ययन मिर्गी बायोमार्कर अनुसंधान के लिए बायोफ्लुइड नमूने के महत्व को उजागर करते हैं, लेकिन वे नैदानिक परीक्षणों के लिए आंतरिक कई सीमाओं का सामना करते हैं, उदाहरण के लिए, रक्त में एंटी-एपिलेप्टिक ड्रग्स (एईडी) का कोफाउंडिंग कारक, एटियलजि जानकारी की लगातार कमी, अपर्याप्त नियंत्रण, रोगियों की मामूली संख्या, और अन्य17,18।
पूर्व-नैदानिक अनुसंधान मिर्गी के लिए संभावित बायोमार्कर के रूप में बायोफ्लुइड में अणुओं की जांच के लिए अन्य अवसर प्रदान करता है। वास्तव में, ईईजी रिकॉर्डिंग करते समय जानवरों से प्लाज्मा और / या सीएसएफ को वापस लेना संभव है। इसके अलावा, प्रयोग के कई दिनों में नमूनाकरण बार-बार किया जा सकता है, और अध्ययन की मजबूती में सुधार के लिए कई उम्र, लिंग और मिर्गी के अपमान-मिलान वाले नियंत्रणों का उपयोग किया जा सकता है। यहां, ईईजी-निगरानी चूहों में पूंछ नस से प्लाज्मा की समानांतर वापसी के साथ सिस्टर्न मैग्ना से सीएसएफ प्राप्त करने के लिए एक लचीली तकनीक विस्तार से वर्णित है। प्रस्तुत तकनीक के वैकल्पिक तरीकों पर कई फायदे हैं। एक तितली सुई दृष्टिकोण का उपयोग करके, ईईजी इलेक्ट्रोड या इसी तरह के सिर प्रत्यारोपण के कार्य से समझौता किए बिना कई बार सीएसएफ एकत्र करना संभव है। यह intrathecal कैथेटर वापसी प्रक्रियाओं के शोधन का प्रतिनिधित्व करता है, जो संक्रमण का एक अपेक्षाकृत उच्च जोखिम के साथ जुड़े रहे हैं. इसके अलावा, रक्त संग्रह के लिए उपयोग किया जाने वाला रिपोर्ट किया गया फ्री फॉल ड्रॉपिंग दृष्टिकोण हेमोलिसिस के अत्यधिक कम जोखिम के कारण पूंछ नस रक्त वापसी के अन्य दृष्टिकोणों से बेहतर है, इस तथ्य के कारण कि रक्त टयूबिंग से नहीं गुजरता है और कोई वैक्यूम दबाव लागू नहीं होता है। यदि सख्त रोगाणु मुक्त परिस्थितियों में प्रदर्शन किया जाता है, तो जानवरों के लिए संक्रमण का विशेष रूप से कम जोखिम होता है। इसके अलावा, जानवरों की पूंछ के बहुत अंत में रक्त निकासी शुरू करके, नमूना कई बार दोहराया जा सकता है। ऐसी तकनीकों में महारत हासिल करना आसान है और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र विकारों के कई प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान कार्य चूहों में सीएसएफ और रक्त संग्रह की एक आसान-से-मास्टर तकनीक दिखाता है, जो न केवल मिर्गी के मॉडल में अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है, बल्कि अन्य न्यूरोलॉजिकल स्थितियों या अल्जाइमर, पार्किंस?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को अनुदान समझौते 964712 (PRIME; M. Simonato) के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 कार्य कार्यक्रम (H2020-FETOPEN-2018-2020 पर कॉल करें) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
| Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
| Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | Material |
| Centrifuge refrigerated ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | Material |
| Cotton suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
| Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | Solution |
| Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | Equipment |
| Digital video surveillance system of tethered EEG set up | EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipment |
| Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
| Dummy guide cannula 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | Material |
| Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| Electrode holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
| Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL |
Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
| Eppendorf μCuvette G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | Equipment |
| Feeding needle flexible 17G for rat | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
| Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | Material |
| Microinjection cannula 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | Material |
| MP150 modular data acquisition and analysis system | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| Ophthalmic vet ointment, Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | Material |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
| PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
| Saline | 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 | Solution | |
| Scopolamine hydrobromide trihydrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | Material |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | Material |
| Silver sulfadiazine 1% cream | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
| Simplex rapid dental methacrylic cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | Equipment |
| Sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Home-made | Solution |
| Syringe 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
| Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | Material |
| Telemetry EEG traces analyzer | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
| Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | Hardware plus software Ponemah core 6.51 | Equipment |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | Material |
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