Экспрессия трансгена в культивируемых клетках с использованием неочищенных рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов

1. Получение плазмид ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол клонирует интересующий ген (GOI) в ITR-содержащую плазмиду с промотором цитомегаловируса (ЦМВ) и последовательностью полиаденилирования SV40 (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). Тем не менее, эта плазмида может быть использована без дальнейшего клонирования для получения rAAV, упаковывая удобный двойной репортер EGFP и Luciferase. Плазмиды с различными регуляторными элементами или для различных применений, например, для экспериментов на основе CRISPR, доступны в Интернете и будут следовать тем же этапам клонирования, что и ниже (см. обсуждение дополнительных этапов клонирования). Кроме того, могут быть использованы rep/cap или транс-плазмиды для разных серотипов — этот протокол будет использовать rep/cap для серотипа AAV 2. Приобретите бактериальные таблетки, содержащие цис-плазмиду ITR, вспомогательную плазмиду аденовируса, плазмиду rep/cap и плазмиду, содержащую GOI. Нанесите бактерии на отдельные агаровые пластины, содержащие антибиотики, специфичные для резистентности каждой плазмиды. Инкубируйте бактерии при температуре 30 °C в течение ночи, чтобы они выросли.ПРИМЕЧАНИЕ: Если плазмида с ГОИ недоступна для покупки, синтетический фрагмент ДНК (см. Таблицу материалов) можно приобрести в Интернете. Кроме того, при желании можно использовать синтетический фрагмент ДНК, чтобы пропустить весь процесс ПЦР. Возьмите по одной колонии с каждой пластины и вырастите в 3 мл буфера Лурии Бертани (LB), дополненного соответствующим антибиотиком при 30 °C в течение ночи, встряхивая при 180 оборотах в минуту. Переложите 1 мл бактерий в стерильную колбу Эрленмейера объемом 250 мл, содержащую 50 мл буфера LB с добавлением соответствующего антибиотика. Встряхните при 30 °C, 180 об/мин в течение ночи. Переложите бактерии в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугу на 20 минут при температуре 3 000 x g при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость. Изолируйте плазмиду с помощью набора мидипрепов с низким или свободным содержанием эндотоксинов в соответствии с инструкциями производителя.ПРИМЕЧАНИЕ: РМЭ являются нестабильными структурами. Чтобы предотвратить делеции или мутации ITR, бактериальные клетки следует выращивать при 30 °C, чтобы замедлить деление клеток и смягчить ошибки репликации. Для увеличения выхода и чистоты плазмид идеально подходит набор midiprep или maxiprep. Рекомендуется использовать набор с низким или свободным содержанием эндотоксинов, чтобы уменьшить последующее загрязнение клеток эндотоксинами. Нет необходимости проводить выделение плазмид внутри ламинарного колпака, так как контаминация плазмидного препарата маловероятна, если она выполняется на стандартном стенде. 2. Клонирование интересующего гена в AAV ITR-содержащую плазмиду Откройте карту плазмиды, содержащую ГОИ, в программе для просмотра ДНК.ПРИМЕЧАНИЕ: Полная кассета, включая РМЭ, не должна превышать 4,9 кб из-за ограничений физической упаковки капсида. Кроме того, амплификация ПЦР не может быть достигнута с помощью РМЭ из-за вторичных структур. Таким образом, сборка Gibson не рекомендуется для клонирования трансгена rAAV.Перейдите на вкладку Последовательность, чтобы отобразить полную последовательность плазмиды. Прокрутите до самой 5′ области последовательности GOI и нажмите на первый нуклеотид , одновременно перетаскивая внутрь к телу гена, чтобы создать передний праймер. Выпускайте после достижения температуры плавления (Tm) ~55 °C. Нажмите кнопку Forward Primer. Вручную включите последовательность для сайта ограничения EcoRI (5′ GAATTC 3′) на самом 5′ конце последовательности праймеров. Кроме того, добавьте шесть дополнительных случайных оснований на 5′-конце этого сайта рестрикции, чтобы фермент мог эффективно взаимодействовать с ДНК. Нажмите кнопку Добавить праймер. Репрезентативный пример приведен на рисунке 2. Проверьте праймер, чтобы убедиться, что он не может образовывать шпильки или димеры праймера (за исключением места рестрикции, которое является палиндромическим). Если образуются шпильки, измените случайную последовательность шести дополнительных оснований. Кроме того, убедитесь, что праймер не связывается где-либо еще на плазмиде. Повторите шаги, чтобы создать обратный праймер в самой 3′-области ГОИ внутрь к телу гена. Нажмите на Reverse Primer и включите сайт ограничения NotI (5′ GCGGCCGC 3′).ПРИМЕЧАНИЕ: ГОИ не может содержать сайты рестрикции EcoRI или NotI – в этом случае необходимо использовать другие ферменты рестрикции. Амплифицируют ГОИ в реакции ПЦР 50 мкл. Используйте необходимые отдельные компоненты из таблицы 1.Поместите реакцию в амплификатор и следуйте параметрам цикла из таблицы 2 для программирования. Если праймеры имеют разную T m, используйте для программы нижнюю Tm. Проверьте амплификацию правильного фрагмента ПЦР, добавив 1 мкл красителя с загрузкой геля (6x) к 5 мкл реакции ПЦР. Запустите лестницу ДНК и смесь ПЦР на 0,8% агарозном геле, содержащем бромид этидия, и визуализируйте с помощью ультрафиолетового света.ВНИМАНИЕ: Бромид этидия является известным мутагеном. Если на геле появляется одна специфическая полоса, очистите оставшийся продукт ПЦР в пробирке для ПЦР-полосок с помощью набора для очистки ПЦР на основе колонки в соответствии с инструкциями производителя. Если появляется несколько полос (из-за неспецифической амплификации), иссеките нужную полосу и очистите ДНК с помощью набора для гелевой экстракции в соответствии с инструкциями производителя. Дигестируют очищенный продукт ПЦР и основную плазмиду pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 в реакции 50 мкл с требуемыми отдельными компонентами из таблицы 3 в течение 1 ч при 37 °C. Требуется большее количество плазмидной ДНК pAAV из-за ожидаемого неэффективного восстановления после экстракции геля.ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые ферменты рестрикции являются высокоточными (HF) версиями. Обычный NotI нельзя использовать с буфером CutSmart. Если используются разные ферменты, может потребоваться другая температура инкубации и буфер.Очистите переваренный продукт ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР на основе колонки в соответствии с инструкциями производителя. Готовят переваренную основную плазмиду pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 для гель-электрофореза, добавляя 10 мкл красителя с загрузкой геля (6x) к 50 мкл реакции пищеварения. Нагружают лестницу ДНК, реакцию пищеварения и 250 нг непереваренной плазмиды (отрицательный контроль) на 0,8% агарозный гель, содержащий бромид этидия, с широкими зубьями. Визуализируйте с помощью ультрафиолетового света, вырежьте нужный фрагмент (~4,5 kb) и очистите ДНК с помощью набора для гелевой экстракции в соответствии с инструкциями производителя. Лигируют переваренный продукт ПЦР и расщепленную основную плазмиду pAAV в реакции лигирования 20 мкл с требуемыми отдельными компонентами из таблицы 4. Чтобы рассчитать необходимое количество ПЦР-продуктов, воспользуйтесь формулой 1. Как правило, используют молярное соотношение продукта ПЦР (вкладыша) к основному (pAAV) с массой 50 нг основы.Формула 1 Выполните отрицательный контроль, заменив ПЦР-продукт водой. Инкубируют реакции лигирования при 16 °C в течение ночи или при комнатной температуре в течение 2 ч. Разморозьте флакон с компетентными бактериальными клетками с дефицитом рекомбинации (например, клетками Stbl3) на льду и поместите 50 мкл в пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 3 мкл реакции лигирования непосредственно на клетки и инкубируйте на льду в течение 30 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: РМЭ являются нестабильными структурами и поэтому требуют бактериальных штаммов с дефицитом рекомбинации для ограничения событий делеции и рекомбинации РМЭ. Клетки DH5α можно использовать с перерывами для размножения (один или два раза), но не рекомендуется для длительного использования. Целостность ИТР следует регулярно проверять после очистки мидипрепа.Подвергнуть бактерии тепловому шоку на водяной бане с температурой 42 °C в течение 30 с, затем немедленно перенести на лед на 2 мин. Добавьте 200 мкл буфера LB и встряхивайте в течение 1 ч при 30 °C, 180 об/мин. Распределите 125 мкл смеси на агаровую пластину с соответствующим антибиотиком и инкубируйте в течение ночи (~18 ч) при 30 °C. Выберите несколько клонов и поместите каждый в стерильную пластиковую культуральную пробирку с 3 мл LB, содержащей соответствующий антибиотик. Инкубировать в течение ночи при встряхивании при 30 °C, 180 об/мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить делеции или мутации ITR, бактериальные клетки следует выращивать при 30 °C, чтобы замедлить деление клеток и смягчить ошибки в репликации. Кроме того, следует выбирать более мелкие колонии, так как колонии, не имеющие РМЭ, могут иметь преимущество в росте по сравнению с другими. Пипетку по 1,8 мл каждой культуры в пробирку объемом 2 мл и центрифугу при 6 000 x g в течение 3 мин при комнатной температуре. Изолируйте ДНК с помощью набора miniprep. Оставшиеся 1,2 мл культуры хранят при температуре 4 °C. Проверяйте правильность клонов с помощью секвенирования ДНК или диагностического переваривания ферментов рестрикции.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать последовательность вставки по Сэнгеру, но процессивность с помощью РМЭ не может быть достигнута стандартными методами. РМЭ должны быть проверены с помощью дайджеста ограничений, как описано ниже. Добавьте 50 мл буфера LB, содержащего соответствующий антибиотик, в стерильную колбу Эрленмейера объемом 250 мл. Добавьте 500 мкл оставшейся культуры в колбу и встряхивайте при 30 °C, 180 об/мин до достижения наружного диаметра600 0,2-0,5 (~18 ч). Переложите бактерии в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугу на 20 мин при температуре 3 000 x g, 4 °C. Изолируйте ДНК с помощью набора мидипрепов с низким или свободным содержанием эндотоксинов. Проверьте целостность ITR с помощью 20 мкл диагностического фермента рестрикции с помощью XmaI (или SmaI). Приготовьте реакцию, содержащую 500 нг плазмиды, 0,5 мкл фермента и 1x буфер; инкубируют в течение 1 ч при 37 °С. Запустите реакцию на 0,8% агарозном геле. Если РМЭ не повреждены, то при расщеплении будет получена полоса размером ~2,9 кб и другая полоса размером с кассету. Если эта четкая полоса не наблюдается, ITR может быть не поврежден, и клонирование придется делать заново.ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмиды, содержащие сайты рестрикции XmaI (или SmaI) (в дополнение к тем, которые содержатся в ITR), будут иметь дополнительные полосы, появляющиеся на геле. Рисунок 2: Репрезентативный пример дизайна грунтовки. Прямая и обратная конструкция праймера для трансгена mScarlet (репрезентативный пример). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Количество Компонент Х мкл Матричная ДНК (25 нг) 1 мкл Праймер F (10 мкМ) 1 мкл Праймер R (10 мкМ) 1 мкл dNTP (10 мМ) 10 мкл Буфер Phusion (5x) 1 мкл Фузион-полимераза Х мкл Вода 50 мкл Окончательный том Таблица 1: Реагенты для амплификации ПЦР. Необходимые компоненты для успешной ПЦР-реакции. Шаг Температура Время Начальная денатурация 98 °С 1 мин. 30 циклов 98 °С 10 с Тм грунтовки 30 с 72 °С 30 с на КБ Окончательное продление 72 °С 10 мин Держать 4 °С неопределённо Таблица 2: Программирование амплификации ПЦР. Необходимые параметры цикла для успешного проведения ПЦР-реакции. Количество Компонент Х мкл Продукт ПЦР (1 мкг) или плазмида pAAV (3 мкг) 5 мкл Буфер (10x) 1 мкл ЭкоРИ-ХФ 1 мкл NotI-HF Х мкл Вода 50 мкл Окончательный том Таблица 3: Реагенты для сбраживания. Необходимые компоненты для успешной реакции пищеварения. Количество Компонент Х мкл Вставка (X ng) Х мкл Магистраль (50 нг) 2 мкл Буфер ДНК-лигазы T4 (10x) 1 мкл ДНК-лигаза Т4 Х мкл Вода 20 мкл Окончательный том Таблица 4: Лигирующие реактивы. Необходимые компоненты для успешной реакции лигирования. 3. Получение векторов с помощью трансфекции тройной плазмиды ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие значения оптимизированы для одной лунки из 6-луночной пластины, которая дает окончательный объем подготовки сырой нефти 2 мл. Все значения могут быть увеличены в 10 раз для планшета диаметром 15 см с конечным объемом 20 мл или уменьшены в 4 раза для 24-луночного планшета с конечным объемом 500 мкл. Приготовьте 1 мкг/мкл полиэтиленимина гидрохлорида (PEI) MAX, растворив 100 мг PEI MAX в 100 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте pH до 7,1 с помощью NaOH. Процеживают смесь фильтром 0,22 мкм и замораживают 1 мл аликвоты при -20 °C для длительного хранения. После размораживания храните реагент в течение 1 месяца при температуре 4 °C. Высевают 3 x 10 5 HEK293 или HEK293T клеток в 6-луночную планшет с предварительно подогретой модифицированной орлиной средой Dulbecco (DMEM,4,5 г/л глюкозы, 110 мг/л пирувата натрия) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Доведите до ~75%-90% слияния в инкубаторе, установленном при температуре 37 °C и 5%CO2 (рис. 3).ПРИМЕЧАНИЕ: Было замечено, что клетки, культивируемые с помощью пенициллина/стрептомицина (P/S), снижают выход вектора. Использование надлежащей стерильной техники позволяет избежать необходимости использования P/S, и поэтому не рекомендуется культивировать клетки HEK293 с антибиотиком20. Если P/S требуется в последующих трансдукциях, рекомендуется добавлять P/S в сырую подготовку после сбора урожая. В пробирке объемом 2 мл готовят смесь, содержащую 1,3 мкг pAAV2/2 (Rep/Cap, серотип 2), 1,3 мкг pAAV.GOI, 2,6 мкг pAdΔF6 и безсывороточный (SF) DMEM (4,5 г/л глюкозы, 110 мг/л пирувата натрия) в общем объеме 100 мкл (см. Дополнительную таблицу 1 для удобных расчетов). Подготовьте отрицательный контроль в отдельной пробирке, заменив pRep/Cap любой неродственной плазмидой. Отрицательный контроль учитывает наличие в сыром препарате неупакованной плазмиды pAAV.GOI, которая, возможно, трансфицирует клетки во время трансдукции, хотя и редко.ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида maxiprep или midiprep с низким или свободным от эндотоксинов идеально подходит для тройной трансфекции и, как правило, дает более высокий титр вектора по сравнению с ДНК miniprep, хотя ДНК miniprep может быть использована для быстрого предварительного тестирования. Добавьте 5,2 мкл PEI MAX в плазмидную смесь; это смесь плазмиды:ПЭИ с соотношением 1:1. Хорошо перемешайте, пульсируя 10-15 раз на вихревом миксере, установленном на 7. Если производится несколько векторных препаратов, добавляйте PEI в каждую смесь плазмид с интервалом времени в 1 мин (т.е. препарат 1 при t = 0 мин, препарат 2 при t = 1 мин и т. д.), чтобы обеспечить достаточное время для аспирации лунок и разбавления реакции на следующих стадиях.ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение плазмида и ПЭИ 1:1 считается оптимальным. Тем не менее, отдельные пользователи могут оптимизировать это соотношение для максимальной эффективности. О том, как выполнить оптимизацию PEI, см. обсуждение (см. также Дополнительную таблицу 2). Инкубируйте каждую пробирку ровно 15 минут, а затем разбавьте реакцию 1,9 мл SF DMEM (4,5 г/л глюкозы, 110 мг/л пирувата натрия) до окончательного объема 2 мл. Аккуратно пипеткой 2 раза перемешать. Чрезмерное смешивание разрушает комплексы Plasmid/PEI и приводит к снижению эффективности трансфекции. Отсасывайте среду из лунки и осторожно добавляйте смесь плазмид и PEI по бокам лунки, чтобы предотвратить отслоение клеток. Инкубируют клетки в течение 72 ч при 37 °C и 5%CO2. Лизис и отслоение клеток во время инкубации является нормальным процессом производства rAAV (рис. 4). Рисунок 3: Клетки HEK293, готовые к трансфекции. Идеальное слияние (75%-90%) клеток HEK293, необходимых для трансфекции тройной плазмиды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Клетки HEK293 после трансфекции. Появление клеток HEK293 до и через 1, 2 или 3 дня после трансфекции с pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 и соотношением плазмида:PEI 1:1. Масштабные линейки: 400 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. 4. Заготовка сырых векторных препаратов Замораживают всю пластину трансфицированных клеток в течение 30 мин при -80 °С, затем размораживают в течение 30 мин при 37 °С. Повторите в общей сложности три цикла замораживания/оттаивания. Не снимайте крышку — тарелка должна оставаться стерильной внутри. Пластины могут оставаться при температуре -80 °C до тех пор, пока они не будут готовы к следующим этапам.ПРИМЕЧАНИЕ: Для размораживания лучше всего подходит неувлажненный инкубатор, который сводит к минимуму образование конденсата на внешней стороне планшетов, что может привести к случайному загрязнению. Выполните следующие два шага в ламинарном колпаке с использованием асептических методов. Перемешайте каждую лунку с помощью пипетирования, чтобы обеспечить максимальное разрушение клеток. Переложите лизат в пробирку объемом 2 мл и центрифугу на 15 минут при 15 000 x g, комнатной температуре для удаления клеточного мусора. Осторожно переложите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 2 мл. Этот сырой препарат может быть использован немедленно, без титрования или очистки. Vector может храниться при температуре 4 °C в течение нескольких месяцев или -20 °C в течение многих лет.ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости титры могут быть рассчитаны методом количественной ПЦР (кПЦР) путем количественного определения количества векторных геномов (VG) внутри ДНКаз-резистентных частиц. Таким образом, титры указываются в единицах VG/мл. Вектор, хранящийся в течение нескольких месяцев при 4 °C, следует повторно титровать перед использованием, так как вектор может агрегировать и/или связывать стенки пробирки, снижая титр препарата. 5. Трансдукция Поместите нужный тип ячейки (например, Huh7) в 96-луночный планшет при целевом слиянии 50%-75%, в зависимости от продолжительности трансдукции. Большее слияние может привести к снижению эффективности трансдукции AAV. Добавляйте вектор (например, CMV.mScarlet) в клетки, не зная титра сырого препарата, для применений, где доза не имеет значения, например, для тестирования панели капсидов на трансдукцию в новом типе клеток. Выполните серию разбавлений сырой заготовки в соотношении 1:3 в безсывороточной среде (SF) для получения оптимального количества вектора, необходимого для применения. Отсасывайте среду из 96-луночного планшета и добавляйте в скважины 50-100 мкл разбавленной подготовки сырой нефти. Инкубируют клетки при температуре 37 °C и 5%CO2.ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка может содержать антитела, которые могут нейтрализовать вектор AAV и снижать эффективность трансдукции. Тем не менее, сыворотка может быть использована во время трансдукции для чувствительных типов клеток. Удалить вектор через 48 ч после трансдукции (hpt) и промыть клетки один раз предварительно подогретым фосфатно-солевым буфером (PBS). Векторы также могут быть удалены и заменены средами, содержащими сыворотку, уже через 2 hpt для чувствительных типов клеток. Во многих случаях проводят ночную инкубацию для трансдукции клеток, а утром заменяют лунки свежими средами, содержащими сыворотку. Надежные типы ячеек, такие как Huh7 и U2-OS, не требуют замены среды. Прервать трансдукцию путем фиксации клеток в 4% параформальдегиде (PFA) на 10 мин. В зависимости от области применения также могут использоваться различные методы прерывания (например, лизис). Для большинства типов клеток пик экспрессии приходится на 48 hpt и, таким образом, является общей экспериментальной конечной точкой. 6. Вариации метода трансдукции в зависимости от типа клеток ПРИМЕЧАНИЕ: Для разных типов клеток требуются разные условия культивирования. Поэтому добавление вектора для трансдукции должно быть оптимизировано исходя из потребностей типа клетки. Ниже приведены очень специфические протоколы трансдукции для типов клеток, включенных в репрезентативные результаты, иллюстрирующие некоторые варианты протоколов трансдукции, которые исследователь может захотеть попробовать для своих собственных нужд. Органоиды тонкого кишечника мышиПолучение органоидов тонкого кишечника (mSIO) мышей из тонкокишечной крипты мышей C57BL/6J. Встраивают органоиды в 90% матрицу базальной мембраны и культивируют в 24-луночные планшеты, содержащие либо органоидную питательную среду (без антибиотиков), либо претрансдукционную среду (50% Wnt3a-кондиционированную среду [произведенную на собственном производстве с использованием клеток L Wnt-3A в органоидной питательной среде], 10 мМ никотинамида, 10 мкМ ингибитора ROCK и 2,5 мкМ CHIR99021) в течение одного пассажа (5-7 дней) перед трансдукцией при 37 °C и 5% CO2. Перед трансдукцией органоиды промывают D-PBS, разрушают матричные купола базальной мембраны путем пипетирования и диссоциируют органоиды на небольшие клеточные кластеры, инкубируя их в диссоциационной среде в течение 10 мин при 37 °C и далее пипетируя. Остановите процесс диссоциации клеток, добавив 5% FBS в DMEM/F-12 с 15 мМ HEPES, перенесите кластеры клеток в центрифужные пробирки и собирайте клеточные кластеры центрифугированием в течение 5 минут при 1000 x g, комнатной температуре. Ресуспендировать клеточные кластеры в трансдукционной среде (претрансдукционная среда, содержащая 10 мкг/мл полибрена, или органоидная питательная среда, содержащая 10 мкг/мл полибрена) и перенос в 48-луночные планшеты с последующим добавлением сырых препаратов AAV, упакованных в CMV.mScarlet для трансдукции. Проводят трансдукцию органоидов, центрифугируя планшет в течение 1 ч при 600 x g и 37 °C, а затем инкубируют при 37 °C еще 6 ч. Трансдуцированные органоиды собрать в пробирки для микроцентрифуг объемом 1,5 мл, центрифугировать в течение 5 мин при 1000 x g, комнатной температуре и положить на лед. После удаления надосадочной жидкости ресуспендировать трансдуцированные органоиды в 90% матрице базальной мембраны в претрансдукционной среде или органоидной питательной среде и капли семян по 20 мкл в одну лунку предварительно подогретого камерного покровного стекла. После инкубации в течение 10 мин в инкубаторе поместить каплю в 350 мкл среды для претрансдукции или органоидной питательной среды и инкубировать при 37 °C в инкубаторе. Определяют эффективность трансдукции через 2-5 дней после трансдукции, визуализируя трансдуцированные органоиды на конфокальном микроскопе и оценивая процентное соотношение красных флуоресцентных клеток на органоид. Ячейки BeWoЗа 24 ч до трансдукции пластинчатые клетки плацентарной хориокарциномы человека BeWo по 10 000 клеток на лунку 96-луночного планшета. Развести сырые препараты AAV в упаковке CMV.mScarlet до 1:1 в безсывороточной среде F12-K BeWo до общего объема 50 мкл на лунку. Отсасывайте среду из скважины и заменяйте разбавленным AAV на 50 мкл на лунку. Инкубируют клетки при 37 °C в течение ночи (~18 ч), а затем добавляют 100 мкл среды F12-K BeWo, содержащей 10% FBS, чтобы довести общий объем до 150 мкл. Инкубируйте клетки еще 6 ч, в общей сложности 24 ч после трансдукции (hpt). Для визуализации окрасьте живые клетки красителем Hoechst в течение 30 минут в среде F12-K, затем замените среду на безфеноловый DMEM, содержащий 10% FBS, 1x добавку глутамакса и 1x добавку пирувата натрия для визуализации. Проводите визуализацию живых клеток на конфокальном микроскопе с использованием наборов фильтров DAPI (для визуализации Хёхста) и mCherry (для визуализации mScarlet) с температурой 37 °C и 5% CO2. Клетки Hepa1-6 и Huh7Пластинчатые клетки печени мышей Hepa1-6 и клетки печени человека Huh7 в DMEM (4,5 г/л глюкозы, 110 мг/л пирувата натрия, 10% FBS) при 5000 клеток на лунку 96-луночного планшета за 24 ч до трансдукции. Добавляют 50 мкл неразбавленных сырых препаратов AAV, упаковывающих CMV.mScarlet, непосредственно в клетки и инкубируют при 37 °C в течение 48 ч. Промойте клетки один раз в PBS, закрепите в 4% PFA и покрасьте красителем Hoechst в течение 10 минут. Проводите визуализацию на конфокальном микроскопе с помощью наборов фильтров DAPI (для визуализации Hoechst) и mCherry (для визуализации mScarlet). Ячейки C2C12 и HSkMCПластинчатые недифференцированные миобласты мышей C2C12 и недифференцированные миобласты первичных скелетных мышечных клеток человека (HSkMC) при 5000 клетках на лунку 96-луночной пластины, за 72 ч до трансдукции. Разбавляют сырые препараты AAV в упаковке CMV.mScarlet до 1:1 в DMEM (4,5 г/л глюкозы, Penn/Streps, 20% FBS) для миобластов C2C12 или среды для роста скелетных мышц для миобластов HSkMC. Дифференциация миобластов HSkMC в миотрубки путем замены среды на дифференцировочную среду. Инкубируют миобласты и миотрубки в разбавленных препаратах AAV в течение 24 ч при 37 °C. Окрасьте живые клетки красителем Hoechst в течение 10 минут и получите изображение на конфокальном микроскопе с помощью наборов фильтров DAPI (для визуализации по методу Хёхста) и mCherry (для визуализации mScarlet).