Saflaştırılmamış Rekombinant Adeno İlişkili Viral Vektörler Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Transgen Ekspresyonu

1. Plazmit edinimi NOT: Bu protokol, ilgilenilen bir geni (GOI) bir sitomegalovirüs (CMV) promotörü ve bir SV40 poli-adenilasyon dizisi (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40) ile ITR içeren bir plazmide klonlayacaktır. Bununla birlikte, bu plazmit, rAAV’ler üretmek için daha fazla klonlama yapılmadan, uygun bir çift EGFP ve Lusiferaz raportörünü paketleyerek kullanılabilir. Farklı düzenleyici unsurlara sahip veya CRISPR tabanlı deneyler gibi farklı uygulamalar için plazmitler çevrimiçi olarak mevcuttur ve aşağıdakilere benzer klonlama adımlarını izleyecektir (ek klonlama adımları için tartışmaya bakın). Ek olarak, farklı serotipler için rep/cap veya trans, plazmitler kullanılabilir – bu protokol AAV serotip 2 için rep/cap kullanacaktır. ITR içeren bir cis plazmid, bir adenovirüs yardımcı plazmidi, bir rep/cap plazmidi ve bir GOI içeren bir plazmit içeren bakteri bıçakları satın alın. Bakterileri, her bir plazmidin direncine özgü antibiyotikler içeren ayrı agar plakalarına sürün. Bakterileri büyümek için gece boyunca 30 °C’de inkübe edin.NOT: GOI’li bir plazmit satın alınamıyorsa, sentetik bir DNA parçası (Malzeme Tablosuna bakınız) çevrimiçi olarak satın alınabilir. Ek olarak, istenirse tüm PCR sürecini atlamak için sentetik bir DNA parçası kullanılabilir. Her plakadan tek bir koloni seçin ve gece boyunca 30 ° C’de karşılık gelen antibiyotikle desteklenmiş 3 mL Luria Bertani (LB) tamponunda 180 rpm’de çalkalayarak büyütün. 1 mL bakteriyi, karşılık gelen antibiyotikle desteklenmiş 50 mL LB tamponu içeren steril bir 250 mL Erlenmeyer şişesine aktarın. Gece boyunca 30 °C, 180 rpm’de çalkalayın. Bakterileri 50 mL’lik konik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 3.000 x g’da 20 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Üreticinin talimatlarına göre endotoksin içermeyen veya içermeyen bir midiprep kiti kullanarak plazmidi izole edin.NOT: ITR’ler kararsız yapılardır. ITR delesyonlarını veya mutasyonlarını önlemek için, hücresel bölünmeyi yavaşlatmak ve replikasyondaki hataları azaltmak için bakteri hücreleri 30 °C’de büyütülmelidir. Plazmit verimini ve saflığını artırmak için bir midiprep veya maxiprep kiti idealdir. Hücrelerin aşağı akış endotoksin kontaminasyonunu azaltmak için endotoksin düşük veya içermeyen bir kit kullanılması önerilir. Standart bir tezgahta yapıldığında plazmit preparatının kontaminasyonu olası olmadığından, laminer akış başlığı içinde plazmit izolasyonu yapmak gerekli değildir. 2. İlgilenilen genin AAV ITR içeren plazmide klonlanması GOI’yi içeren plazmid haritasını bir DNA görüntüleme yazılımında açın.NOT: ITR’ler de dahil olmak üzere tam kaset, kapsidin fiziksel paketleme sınırlamaları nedeniyle 4.9 kb’yi geçmemelidir. Ek olarak, ikincil yapılar nedeniyle ITR’ler aracılığıyla PCR amplifikasyonu sağlanamaz. Bu nedenle, Gibson derlemesi rAAV transgen klonlaması için önerilmez.Plazmidin tam dizisini ortaya çıkarmak için Sıra sekmesine tıklayın. GOI dizisinin en 5′ bölgesine gidin ve ileri bir primer oluşturmak için gen gövdesine doğru içe doğru sürüklerken İlk Nükleotid’e tıklayın. ~55 °C’lik bir erime sıcaklığına (Tm) ulaşıldığında bırakın. İleri Primer’a tıklayın. Astar dizisinin 5′ en ucundaki bir EcoRI kısıtlama bölgesi (5′ GAATTC 3′) için sırayı manuel olarak ekleyin. Ek olarak, enzimin DNA ile verimli bir şekilde etkileşime girmesine izin vermek için bu kısıtlama bölgesinin 5′ ucuna altı ekstra rastgele baz ekleyin. Astar Ekle’ye tıklayın. Temsili bir örnek için Şekil 2’ye bakın. Saç tokası veya astar dimerleri oluşturamayacağından emin olmak için astarı kontrol edin (palindromik olan kısıtlama bölgesi hariç). Saç tokaları oluşursa, altı ekstra tabanın rastgele sırasını değiştirin. Ek olarak, astarın plazmit üzerinde başka hiçbir yere bağlanmadığından emin olun. GOI’nin gen gövdesinin içine doğru en fazla 3′ bölgesinde bir ters primer oluşturmak için adımları tekrarlayın. Reverse Primer’a tıklayın ve bir NotI kısıtlama sitesi ekleyin (5′ GCGGCCGC 3′).NOT: GOI, EcoRI veya NotI kısıtlama bölgelerini içeremez – eğer öyleyse, farklı kısıtlama enzimlerinin kullanılması gerekecektir. GOI’yi 50 μL’lik bir PCR reaksiyonunda amplifiye edin. Tablo 1’deki gerekli bileşenleri kullanın.Reaksiyonu bir termodöngüleyiciye yerleştirin ve programlama için Tablo 2’deki döngü parametrelerini izleyin. Primerler farklı T m’ye sahipse, program için alt Tm’yi kullanın. 5 μL PCR reaksiyonuna 1 μL jel yükleme boyası (6x) ekleyerek doğru PCR fragmanının amplifikasyonunu doğrulayın. Etidyum bromür içeren %0.8’lik bir agaroz jel üzerinde bir DNA merdiveni ve PCR karışımı çalıştırın ve UV ışığı ile görselleştirin.DİKKAT: Etidyum bromür bilinen bir mutajendir. Jel üzerinde tek, spesifik bir bant belirirse, üreticinin talimatlarına göre kolon bazlı bir PCR temizleme kiti kullanarak PCR şerit tüpünde kalan PCR ürününü saflaştırın. Birden fazla bant ortaya çıkarsa (spesifik olmayan amplifikasyon nedeniyle), istenen bandı kesin ve üreticinin talimatlarına göre bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA’yı saflaştırın. Saflaştırılmış PCR ürününü ve pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 omurga plazmidini, 37 °C’de 1 saat boyunca Tablo 3’teki gerekli bireysel bileşenlerle 50 μL’lik bir reaksiyonda sindirin. Jel ekstraksiyonunu takiben beklenen verimsiz iyileşme nedeniyle daha büyük miktarda pAAV plazmit DNA’sı gereklidir.NOT: Kullanılan restriksiyon enzimleri yüksek sadakatli (HF) versiyonlardır. Normal NotCutSmart arabelleği ile kullanılamaz. Farklı enzimler kullanılıyorsa, farklı bir inkübasyon sıcaklığı ve tampon gerekebilir.Sindirilmiş PCR ürününü, üreticinin talimatlarına göre kolon tabanlı bir PCR temizleme kiti ile saflaştırın. 50 μL sindirim reaksiyonuna 10 μL jel yükleme boyası (6x) ekleyerek jel elektroforezi için sindirilmiş pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 omurga plazmidini hazırlayın. Geniş dişli kuyucuklara sahip etidyum bromür içeren% 0.8 agaroz jel üzerine bir DNA merdiveni, sindirim reaksiyonu ve 250 ng sindirilmemiş plazmit (negatif kontrol) yükleyin. UV ışığı ile görselleştirin, istenen parçayı (~ 4.5 kb) kesin ve üreticinin talimatlarına göre bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA’yı saflaştırın. Sindirilmiş PCR ürününü ve sindirilmiş pAAV omurga plazmidini, Tablo 4’teki gerekli bireysel bileşenlerle 20 μL’lik bir ligasyon reaksiyonunda bağlayın. İhtiyaç duyulan PCR ürünlerinin miktarını hesaplamak için Formül 1’i kullanın. Tipik olarak, 50 ng omurga kütlesi ile 3:1 molar PCR ürünü (insert) / omurga (pAAV) oranı kullanın.Formül 1 PCR ürününü suyla değiştirerek negatif kontrol gerçekleştirin. Ligasyon reaksiyonlarını gece boyunca 16 °C’de veya oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Yetkin, rekombinasyon eksikliği olan bakteri hücrelerinden (Stbl3 hücreleri gibi) oluşan bir şişeyi buz üzerinde çözdürün ve 50 μL’yi 1.5 mL’lik bir tüpe yerleştirin. 3 μL ligasyon reaksiyonunu doğrudan hücrelere ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.NOT: ITR’ler kararsız yapılardır ve bu nedenle ITR delesyonu ve rekombinasyon olaylarını sınırlamak için rekombinasyon eksikliği olan bakteri suşları gerektirir. DH5α hücreleri, çoğaltma için aralıklı olarak kullanılabilir (bir veya iki kez), ancak uzun süreli kullanım için önerilmez. Midiprep saflaştırmasından sonra ITR bütünlüğü düzenli olarak kontrol edilmelidir.Bakterileri 42 °C’lik bir su banyosunda 30 saniye boyunca ısı şoku uygulayın, ardından hemen 2 dakika boyunca buza aktarın. 200 μL LB tamponu ekleyin ve 30 °C, 180 rpm’de 1 saat çalkalayın. Karışımın 125 μL’sini karşılık gelen antibiyotikle bir agar plakasına yayın ve gece boyunca (~ 18 saat) 30 ° C’de inkübe edin. Birden fazla klon seçin ve her birini karşılık gelen antibiyotiği içeren 3 mL LB içeren steril bir plastik kültür tüpüne yerleştirin. Gece boyunca 30 °C, 180 rpm’de çalkalayın.NOT: ITR delesyonlarını veya mutasyonlarını önlemek için, hücresel bölünmeyi yavaşlatmak ve replikasyondaki hataları azaltmak için bakteri hücreleri 30 °C’de büyütülmelidir. Ek olarak, ITR’leri olmayanlar diğerlerine göre büyüme avantajına sahip olabileceğinden daha küçük koloniler seçilmelidir. Her kültürün 1.8 mL’sini 2 mL’lik bir tüpe pipetleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 6.000 x g’da santrifüjleyin. Bir miniprep kiti kullanarak DNA’yı izole edin. Kalan 1.2 mL kültürü 4 °C’de saklayın. DNA dizilimi veya tanısal kısıtlama enzim sindirimi ile doğru klonları doğrulayın.NOT: Kesici ucun Sanger dizilimi önerilir, ancak ITR’ler aracılığıyla işlenebilirlik standart yöntemlerle elde edilemez. ITR’ler, aşağıda açıklandığı gibi kısıtlama özeti ile doğrulanmalıdır. Steril bir 250 mL Erlenmeyer şişesine karşılık gelen antibiyotiği içeren 50 mL LB tamponu ekleyin. Şişeye 500 μL kalan kültürü ekleyin ve 30 °C, 180 rpm’de 0.2-0.5’lik bir OD600’e ulaşılana kadar (~18 saat) çalkalayın. Bakterileri 50 mL’lik konik bir tüpe aktarın ve 3.000 x g, 4 °C’de 20 dakika santrifüjleyin. Endotoksin içermeyen veya içermeyen bir midiprep kiti kullanarak DNA’yı izole edin. XmaI (veya SmaI) kullanarak 20 μL tanısal kısıtlama enzim sindirimi ile ITR bütünlüğünü kontrol edin. 500 ng plazmid, 0.5 μL enzim ve 1x tampon içeren bir reaksiyon hazırlayın; 37 °C’de 1 saat inkübe edin. Reaksiyonu %0.8’lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın. ITR’ler sağlamsa, sindirim ~ 2.9 kb’de bir bant ve kaset boyutunda başka bir bant verecektir. Bu belirgin bant gözlenmezse, ITR bozulmamış olabilir ve klonlamanın yeniden yapılması gerekecektir.NOT: XmaI (veya SmaI) kısıtlama bölgeleri içeren plazmitler (ITR’lerdekilere ek olarak) jel üzerinde ek bantlar görünecektir. Şekil 2: Astar tasarımı için temsili örnek. Bir mScarlet transgeni için ileri ve geri astar tasarımı (temsili örnek). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Miktar Parça X μL Şablon DNA (25 ng) 1 μL F astar (10 μM) 1 μL R astar (10 μM) 1 μL dNTP (10 mM) 10 μL Phusion Tamponu (5x) 1 μL Phusion Polimeraz X μL Su 50 μL Son Cilt Tablo 1: PCR amplifikasyon reaktifleri. Başarılı bir PCR reaksiyonu için gerekli bileşenler. Adım Sıcaklık Saat İlk denatürasyon 98 °C 1 dk 30 Döngü 98 °C 10 sn Astarın Tm’si 30 saniye 72 °C KB başına 30 sn Son Uzatma 72 °C 10 dk Tutmak 4 °C Sonsuza kadar Tablo 2: PCR amplifikasyon programlaması. Başarılı bir PCR reaksiyonu için gerekli döngü parametreleri. Miktar Parça X μL PCR ürünü (1μg) veya pAAV plazmidi (3μg) 5 μL Tampon (10x) 1 μL EcoRI-HF Serisi 1 μL NotI-HF X μL Su 50 μL Son Cilt Tablo 3: Sindirim reaktifleri. Başarılı bir sindirim reaksiyonu için gerekli bileşenler. Miktar Parça X μL Ekle (X ng) X μL Omurga (50 ng) 2 μL T4 DNA Ligaz Tamponu (10x) 1 μL T4 DNA Ligaz X μL Su 20 μL Son Cilt Tablo 4: Ligasyon reaktifleri. Başarılı bir ligasyon reaksiyonu için gerekli bileşenler. 3. Üçlü plazmid transfeksiyonu ile vektör üretimi NOT: Aşağıdaki değerler, 2 mL’lik bir nihai ham hazırlama hacmi veren 6 oyuklu bir plakanın tek bir kuyusu için optimize edilmiştir. Tüm değerler, 20 mL’lik bir nihai hacim veren 15 cm’lik bir plaka için 10 kat büyütülebilir veya 500 μL’lik bir nihai hacme sahip 24 oyuklu bir plaka için 4 kat küçültülebilir. 100 mg PEI MAX’ı 100 mL damıtılmış suda çözerek 1 μg/μL’lik bir polietilenimin hidroklorür (PEI) MAX stoğu yapın. NaOH ile pH’ı 7.1’e ayarlayın. Filtre: Karışımı 0,22 μm’lik bir filtre ile sterilize edin ve uzun süreli saklama için -20 °C’de 1 mL alikotları dondurun. Çözüldükten sonra reaktifi 4 °C’de 1 ay saklayın. 3 x 10 5 HEK293 veya HEK293T hücreleri, önceden ısıtılmış Dulbecco’nun modifiye edilmiş kartal ortamı (DMEM,4.5 g / L glikoz, 110 mg / L sodyum piruvat) ile 6 oyuklu bir plakaya tohumlayın,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiştir. 37 °C ve O2’ye ayarlanmış bir inkübatörde ~-90 birleşmeye kadar büyür (Şekil 3).NOT: Penisilin / streptomisin (P / S) ile kültürlenen hücrelerin vektör üretim verimini azalttığı gözlenmiştir. Uygun steril tekniğin kullanılması P / S kullanma ihtiyacını ortadan kaldırır ve bu nedenle HEK293 hücrelerinin antibiyotik20 ile kültürlenmemesi önerilir. Aşağı akış transdüksiyonlarında P/S gerekiyorsa, hasattan sonra ham preparasyona P/S eklenmesi önerilir. 2 mL’lik bir tüpte, 1.3 μg pAAV2 / 2 (Rep / Cap, serotip 2), 1.3 μg pAAV.GOI, 2.6 μg pAdΔF6 ve serumsuz (SF) DMEM (4.5 g / L glikoz, 110 mg / L sodyum piruvat) içeren bir karışım hazırlayın toplam 100 μL hacme (uygun hesaplamalar için Ek Tablo 1’e bakın). pRep / Cap’i herhangi bir ilgisiz plazmit ile değiştirerek ayrı bir tüpte negatif bir kontrol hazırlayın. Negatif kontrol, nadir de olsa, transdüksiyon sırasında hücreleri transfekte edebilen ham preparatta bulunan paketlenmemiş pAAV.GOI plazmidini açıklar.NOT: Endotoksin içermeyen veya içermeyen maxiprep veya midiprep plazmid, üçlü transfeksiyon için idealdir ve genellikle miniprep DNA’ya kıyasla daha yüksek titre vektörü üretir, ancak miniprep DNA’sı hızlı ve kirli ön testler için kullanılabilir. Plazmid karışımına 5.2 μL PEI MAX ekleyin; Bu, 1:1 oranına sahip bir plazmit:PEI karışımıdır. 7’ye ayarlanmış bir vorteks karıştırıcıda 10-15 kez vurarak iyice karıştırın. Birden fazla vektör preparatı üretilirse, kuyucukları aspire etmek ve aşağıdaki adımlarda reaksiyonu seyreltmek için yeterli zamanlamaya izin vermek için her bir plazmit karışımına 1 dakikalık kademeli zaman aralıklarında (yani, t = 0 dakikada preparat 1, t = 1 dakikada preparat 2, vb.) PEI ekleyin.NOT: 1:1 plazmit:PEI oranının optimal olduğu gözlemlenmiştir. Ancak, bireysel kullanıcılar maksimum verimlilik için bu oranı optimize edebilir. PEI optimizasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini öğrenmek için tartışmaya bakın (ayrıca Ek Tablo 2’ye bakınız). Her tüpü tam olarak 15 dakika inkübe edin ve ardından reaksiyonu 2 mL’lik bir son hacim için 1.9 mL SF DMEM (4.5 g / L glikoz, 110 mg / L sodyum piruvat) ile seyreltin. Karıştırmak için 2 kez hafifçe pipetleyin. Aşırı karıştırma, Plazmid/PEI komplekslerini bozacak ve daha düşük transfeksiyon verimliliğine neden olacaktır. Ortamı kuyudan aspire edin ve hücresel ayrılmayı önlemek için plazmid: PEI karışımını kuyu taraflarına hafifçe ekleyin. Hücreleri 37 ° C’de ve% 5 CO2’de 72 saat inkübe edin. İnkübasyon sırasında hücre parçalanması ve ayrılması, rAAV üretiminin normal bir sürecidir (Şekil 4). Şekil 3: HEK293 hücreleri transfeksiyona hazır. Üçlü plazmit transfeksiyonu için gerekli olan HEK293 hücrelerinin ideal birleşimi (% 75 -% 90). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Transfeksiyon sonrası HEK293 hücreleri. HEK293 hücrelerinin pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 ve 1:1 plazmid:PEI oranı ile transfeksiyondan 1, 2 veya 3 gün sonra görünümü. Ölçek çubukları: 400 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 4. Ham vektör preparatlarının toplanması Transfekte edilmiş hücrelerin tüm plakasını -80 °C’de 30 dakika dondurun, ardından 37 °C’de 30 dakika çözün. Toplam üç donma/çözülme döngüsü için tekrarlayın. Kapağı çıkarmayın – plaka içeride steril kalmalıdır. Plakalar sonraki adımlara geçmeye hazır olana kadar -80 °C’de kalabilir.NOT: Nemlendirilmemiş bir inkübatör, çözdürme için en iyi sonucu verir, bu da plakaların dışında kazara kirlenmeye yol açabilecek yoğuşmayı en aza indirir. Aseptik teknikler kullanarak laminer akış başlığında aşağıdaki iki adımı gerçekleştirin. Hücrelerin maksimum bozulmasını sağlamak için her bir kuyuyu pipetleyerek karıştırın. Lizatı 2 mL’lik bir tüpe aktarın ve hücre kalıntılarını gidermek için oda sıcaklığında 15.000 x g’da 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice yeni bir 2 mL’lik tüpe aktarın. Bu ham preparat, titrasyon veya saflaştırma olmadan hemen kullanılabilir. Vektör 4 ° C’de birkaç ay veya -20 ° C’de yıllarca saklanabilir.NOT: Gerekirse, titreler, DNaz’a dirençli partiküllerin içindeki vektör genomlarının (VG) sayısını ölçerek kantitatif PCR (qPCR) ile hesaplanabilir. Bu nedenle, titreler VG/mL birimlerinde verilir. 4 ° C’de birkaç ay saklanan vektör, kullanılmadan önce yeniden titre edilmelidir, çünkü vektör tüp duvarlarını toplayabilir ve / veya bağlayabilir, bu da preparatın titresini azaltabilir. 5. İletim İstenen hücre tipini (örneğin, Huh7) 96 oyuklu bir plakada, transdüksiyon süresine bağlı olarak% 50 -% 75’lik bir hedef birleşmede plakalayın. Daha fazla birleşme, AAV iletim verimliliğinin azalmasına neden olabilir. Yeni bir hücre tipinde transdüksiyon için bir kapsid panelinin test edilmesi gibi, dozun ilgili olmadığı uygulamalar için ham preparatın titresini bilmeden hücrelere vektör (örneğin, CMV.mScarlet) ekleyin. Uygulama için gereken optimum vektör miktarını elde etmek için serumsuz (SF) ortamda ham preparatın 1:3 seyreltme serisini gerçekleştirin. 96 oyuklu plakadan ortamı aspire edin ve kuyucuklara 50-100 μL seyreltilmiş ham preparat ekleyin. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2’de inkübe edin.NOT: Serum, AAV vektörünü nötralize edebilen ve transdüksiyon verimliliğini azaltabilen antikorlar içerebilir. Bununla birlikte, hassas hücre tipleri için transdüksiyon sırasında serum kullanılabilir. Transdüksiyondan 48 saat sonra (hpt) vektörü çıkarın ve hücreleri önceden ısıtılmış fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez yıkayın. Vektörler ayrıca hassas hücre tipleri için 2 hpt kadar kısa sürede çıkarılabilir ve serum içeren ortamla değiştirilebilir. Birçok uygulama için, hücreleri dönüştürmek için gece boyunca inkübasyon yapın ve sabahları kuyucukları taze serum içeren ortamla değiştirin. Huh7 ve U2-OS gibi sağlam hücre tipleri, ortam değişikliği gerektirmez. Hücreleri 10 dakika boyunca %4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitleyerek transdüksiyonu sonlandırın. Uygulamaya bağlı olarak çeşitli sonlandırma yöntemleri de kullanılabilir (örn. lizis). Çoğu hücre tipi için, tepe ekspresyonu 48 hpt ile gerçekleşir ve bu nedenle yaygın bir deneysel son noktadır. 6. Hücre tipine göre transdüksiyon yöntemindeki varyasyonlar NOT: Farklı hücre tipleri, farklı kültür koşulları gerektirir. Bu nedenle, transdüksiyon için vektör ilavesi, hücre tipinin ihtiyaçlarına göre optimize edilmelidir. Aşağıda, bir araştırmacının kendi ihtiyaçları için denemek isteyebileceği bazı transdüksiyon protokolleri varyasyonlarını gösteren, temsili sonuçlara dahil edilen hücre tipleri için çok spesifik transdüksiyon protokolleri bulunmaktadır. Fare ince bağırsak organoidleriFare ince bağırsak organoidlerini (mSIO’lar) C57BL / 6J farelerinden ince bağırsak kript preparatından türetin. Organoidleri% 90 bazal membran matrisine gömün ve organoid büyüme ortamı (antibiyotiksiz) veya ön transdüksiyon ortamı (% 50 Wnt3a şartlandırılmış ortam [organoid büyüme ortamında L Wnt-3A hücreleri kullanılarak kurum içinde üretilir], 10 mM nikotinamid, 10 μM ROCK inhibitörü ve 2.5 μM CHIR99021) 37 ° C ve% 5 CO2’de transdüksiyondan önce bir geçiş (5-7 gün) için. Transdüksiyondan önce, organoidleri D-PBS ile durulayın, pipetleme yoluyla bazal membran matris kubbelerini bozun ve organoidleri ayrışma ortamında 37 °C’de 10 dakika inkübe ederek ve daha fazla pipetleyerek küçük hücre kümelerine ayırın. 15 mM HEPES ile DMEM / F-12’ye %5 FBS ekleyerek hücre ayrışma sürecini durdurun, hücre kümelerini santrifüj tüplerine aktarın ve 1000 x g, oda sıcaklığında 5 dakika santrifüjleme ile hücre kümelerini toplayın. Hücre kümelerini transdüksiyon ortamında (10 μg/mL polibren içeren ön transdüksiyon ortamı veya 10 μg/mL polibren içeren organoid büyüme ortamı) yeniden süspanse edin ve 48 oyuklu plakalara aktarın, ardından AAV ham preparatları ambalajı CMV.mScarlet’in eklenmesi transdüksiyon için. Plakayı 600 x g ve 37 ° C’de 1 saat santrifüjleyerek organoidlerin transdüksiyonunu gerçekleştirin ve ardından 37 ° C’de 6 saat daha inkübe edin. Dönüştürülmüş organoidleri 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde toplayın, 1000 x g, oda sıcaklığında 5 dakika santrifüjleyin ve buza koyun. Süpernatantın çıkarılmasından sonra, transdüksiyon öncesi ortamda veya organoid büyüme ortamında bazal membran matrisinde dönüştürülmüş organoidleri ve 20 μL’lik tohum damlacıklarını önceden ısıtılmış odacıklı bir kapak camının bir kuyusuna yeniden süspanse edin. İnkübatörde 10 dakika inkübattan sonra, damlacığı 350 μL ön transdüksiyon ortamına veya organoid büyüme ortamına gömün ve inkübatörde 37 ° C’de inkübe edin. Transdüksiyondan 2-5 gün sonra, transdüksiyon verimliliğini konfokal bir mikroskopta görüntüleyerek belirleyin ve organoid başına kırmızı floresan hücrelerin yüzdesini tahmin edin. BeWo hücreleriTransdüksiyondan 24 saat önce, plaka insan plasental koryokarsinomu BeWo hücreleri, 96 oyuklu plakanın oyuğu başına 10.000 hücrede. Ham AAV preparatları ambalajı CMV.mScarlet’i serum içermeyen F12-K BeWo ortamında oyuk başına toplam 50 μL hacme kadar 1:1 oranında seyreltin. Ortamı kuyudan aspire edin ve oyuk başına 50 μL seyreltilmiş AAV ile değiştirin. Hücreleri gece boyunca 37 °C’de (~ 18 saat) inkübe edin ve ardından toplam hacmi 150 μL’ye çıkarmak için% 10 FBS içeren 100 μL F12-K BeWo ortamı ekleyin. Transdüksiyon sonrası (hpt) toplam 24 saat için hücreleri 6 saat daha inkübe edin. Görüntüleme için, canlı hücreleri F12-K ortamında 30 dakika boyunca Hoechst boyası ile boyayın, ardından ortamı görüntüleme için FBS, 1x glutamax takviyesi ve 1x sodyum piruvat takviyesi içeren fenol içermeyen DMEM ile değiştirin. 37 °C ve %5 CO2 ile DAPI (Hoechst görüntüleme için) ve mCherry (mScarlet görüntüleme için) filtre setleri kullanarak konfokal mikroskopta canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. Hepa1-6 ve Huh7 hücreleriTransdüksiyondan 24 saat önce 96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 5.000 hücrede DMEM’de (4.5 g / L glikoz, 110 mg / L sodyum piruvat,% 10 FBS) plaka murin Hepa1-6 karaciğer hücreleri ve insan Huh7 karaciğer hücreleri. CMV.mScarlet’i doğrudan hücrelere 50 μL seyreltilmemiş ham AAV preparatları ambalajı ekleyin ve 37 °C’de 48 saat inkübe edin. Hücreleri PBS’de bir kez yıkayın,% 4 PFA’da sabitleyin ve 10 dakika boyunca Hoechst boyası ile boyayın. DAPI (Hoechst görüntüleme için) ve mCherry (mScarlet görüntüleme için) filtre setlerini kullanarak konfokal mikroskopta görüntüleme yapın. C2C12 ve HSkMC hücreleriPlaka farklılaşmamış murin C2C12 miyoblastları ve farklılaşmamış insan primer iskelet kası hücresi (HSkMC) miyoblastları, transdüksiyondan 72 saat önce, 96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 5.000 hücrede. Ham AAV preparatları ambalajı CMV.mScarlet’i C2C12 miyoblastları veya HSkMC miyoblastları için iskelet kası büyüme ortamı için DMEM’de (4,5 g/L glikoz, Penn/Strep, FBS) 1:1’e kadar seyreltin. Ortamı farklılaşma ortamına değiştirerek HSkMC miyoblastlarını miyotüplere ayırt edin. Miyoblastları ve miyotüpleri seyreltilmiş AAV preparatlarında 37 ° C’de 24 saat inkübe edin. Canlı hücreleri 10 dakika boyunca Hoechst boyası ile boyayın ve DAPI (Hoechst görüntüleme için) ve mCherry (mScarlet görüntüleme için) filtre setlerini kullanarak konfokal mikroskopta görüntüleyin.