未精製組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた培養細胞における導入遺伝子発現

1. プラスミドの取得 注:このプロトコルは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターとSV40ポリアデニル化シーケンス(pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40)を備えたITR含有プラスミッドに関心のある遺伝子(GOI)をクローニングします。ただし、このプラスミドは、さらにクローニングすることなく、便利なデュアルEGFPおよびルシフェラーゼレポーターをパッケージングしてrAAVを産生するために使用できます。調節要素が異なるプラスミドや、CRISPRベースの実験など、さまざまなアプリケーション用のプラスミドはオンラインで入手でき、以下と同様のクローニング手順に従います(追加のクローニング手順については、説明を参照してください)。さらに、異なる血清型用のrep/capまたは trans プラスミドを使用することができ、このプロトコルではAAV血清型2にrep/capを使用します。 ITR含有 シス プラスミド、アデノウイルスヘルパープラスミド、レップ/キャッププラスミド、およびGOIを含むプラスミドを含む細菌スタブを購入します。各プラスミドの耐性に特異的な抗生物質を含む個々の寒天プレートに細菌をストリークします。バクテリアを30°Cで一晩インキュベートして増殖させます。注:GOIを含むプラスミドがすぐに購入できない場合は、合成DNA断片( 材料表を参照)をオンラインで購入できます。さらに、合成DNA断片を使用して、必要に応じてPCRプロセス全体をスキップできます。 各プレートからコロニーを1つ選び、対応する抗生物質を添加した3 mLのLuria Bertani(LB)バッファー中で、30°Cで180rpmで一晩振とうしながら増殖させます。1 mLの細菌を、対応する抗生物質を添加した50 mLのLB緩衝液を含む滅菌250 mL三角フラスコに移します。30°C、180rpmで一晩振とうします。 バクテリアを50 mLのコニカルチューブに移し、室温で3,000 x gで20分間遠心分離します。上澄みを捨てます。メーカーの指示に従って、エンドトキシン低またはフリーのミディプレップキットを使用してプラスミドを単離します。注: ITR は不安定な構造です。ITRの欠失や突然変異を防ぐには、細菌細胞を30°Cで増殖させて細胞分裂を遅らせ、複製のエラーを軽減する必要があります。プラスミドの収量と純度を高めるには、midiprepまたはmaxiprepキットが理想的です。エンドトキシン低またはエンドトキシンフリーキットを使用して、下流の細胞のエンドトキシン汚染を減らすことをお勧めします。プラスミド単離は、標準的なベンチで行えばプラスミド調製の汚染が起こりにくいため、層流フード内で行う必要はありません。 2. AAV ITR含有プラスミドへの目的遺伝子のクローニング GOIを含むプラスミドマップをDNA表示ソフトウェアで開きます。注:キャプシドの物理的なパッケージングの制限により、ITRを含むフルカセットは4.9 kbを超えてはなりません。さらに、PCR増幅は二次構造のためITRでは達成できません。そのため、ギブソンアセンブリーはrAAV導入遺伝子クローニングには推奨されません。[ Sequence ] タブをクリックすると、プラスミドの完全な配列が表示されます。GOI配列の5’最も領域までスクロールし、 第1ヌクレオチド をクリックしながら遺伝子本体に向かって内側にドラッグして、フォワードプライマーを作成します。融解温度(Tm)が~55°Cに達したら放出します。 [ Forward Primer] をクリックします。EcoRI制限部位(5′ GAATTC 3′)の配列をプライマー配列の最末端5’に手動で含めます。さらに、この制限部位の5’末端に6つのランダム塩基を追加して、酵素がDNAと効率的に相互作用できるようにします。「 プライマーを追加」をクリックします。代表的な例として、 図 2 を参照してください。 プライマーをチェックして、ヘアピンまたはプライマー二量体を形成しないことを確認します(回文性の制限部位を除く)。ヘアピンが形成された場合は、6つの余分なベースのランダムなシーケンスを変更します。さらに、プライマーがプラスミドの他の場所に結合していないことを確認してください。 これらの手順を繰り返して、GOIの遺伝子本体の内側の3’最先端領域にリバースプライマーを作製します。 Reverse Primer をクリックし、NotI制限部位(5′ GCGGCCGC 3′)を含めます。注:GOIにはEcoRIまたはNotIの制限部位を含めることはできません – もしそうなら、異なる制限酵素を使用する必要があります。 50 μL の PCR 反応で GOI を増幅します。 表 1 の必要な個々のコンポーネントを使用します。反応液をサーモサイクラーに入れ、 表2 のサイクルパラメータに従ってプログラミングします。プライマーのTmが異なる場合は、プログラムに低いTm を使用します。 5 μLのPCR反応液に1 μLのゲルローディング色素(6x)を添加して、正しいPCRフラグメントの増幅を確認します。臭化エチジウムを含む0.8%アガロースゲル上でDNAラダーとPCR混合物を泳動し、UV光で可視化します。注意:エチジウムブロマイドは既知の変異原です。 ゲル上に単一の特定のバンドが現れた場合は、メーカーの指示に従って、カラムベースのPCRクリーンアップキットを使用して、PCRストリップチューブ内の残りのPCR産物を精製します。(非特異的増幅により)複数のバンドが現れた場合は、目的のバンドを切除し、メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用してDNAを精製します。 精製したPCR産物とpAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40バックボーンプラスミドを、 表3 の必要な個別成分と50 μLの反応液で37°Cで1時間消化します。 ゲル抽出後の回収効率が悪いと予想されるため、大量のpAAVプラスミドDNAが必要です。注:使用される制限酵素はハイフィデリティ(HF)バージョンです。通常のNotIは、CutSmartバッファでは使用できません。異なる酵素を使用する場合は、異なるインキュベーション温度とバッファーが必要になることがあります。消化されたPCR産物を、メーカーの指示に従ってカラムベースのPCRクリーンアップキットで精製します。 ゲル電気泳動用の消化pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40バックボーンプラスミドを、10 μLのゲルローディング色素(6x)を50 μLの消化反応液に添加して調製します。DNAラダー、消化反応、および250 ngの未消化プラスミド(ネガティブコントロール)を、エチジウムブロマイドを含む0.8%アガロースゲルにロードし、歯の幅が広いウェルがあります。UV光で可視化し、目的のフラグメント(~4.5 kb)を切除し、メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用してDNAを精製します。 消化したPCR産物と消化したpAAVバックボーンプラスミドを、 表4の必要な個々の成分を用いて20 μLのライゲーション反応でライゲーションします。必要なPCR産物の量を計算するには、式1を使用します。通常、PCR産物(インサート)とバックボーン(pAAV)のモル比は3:1で、質量は50 ngのバックボーンを使用します。フォーミュラ1 PCR産物を水に置き換えてネガティブコントロールを行います。ライゲーション反応液を16°Cで一晩、または室温で2時間インキュベートします。 コンピテントで組換え欠損の細菌細胞(Stbl3細胞など)のバイアルを氷上で解凍し、50 μLを1.5 mLチューブに入れます。ライゲーション反応液3 μLを細胞に直接添加し、氷上で30分間インキュベートします。注:ITRは不安定な構造であるため、ITRの欠失と組換えイベントを制限するには、組換え欠損細菌株が必要です。DH5α細胞は、増殖のために断続的に(1回または2回)使用できますが、長期使用には推奨されません。ITRの完全性は、ミディプレップ精製後に定期的にチェックする必要があります。バクテリアを42°Cのウォーターバスで30秒間ヒートショックした後、すぐに氷に移して2分間加熱します。200 μL の LB バッファーを添加し、30 °C、180 rpm で 1 時間振とうします。 125 μLの混合物を対応する抗生物質を含む寒天プレートに広げ、30°Cで一晩(~18時間)インキュベートします。 複数のクローンをピックし、それぞれに対応する抗生物質を含む 3 mL の LB が入った滅菌プラスチック培養チューブに入れます。30°C、180rpmで一晩振とうしてインキュベートします。注:ITRの欠失や突然変異を防ぐには、細菌細胞を30°Cで増殖させて細胞分裂を遅らせ、複製のエラーを軽減する必要があります。さらに、ITRのないコロニーは他のコロニーよりも成長に有利である可能性があるため、より小さなコロニーを選択する必要があります。 各培養液1.8 mLを2 mLのチューブにピペットで移し、6,000 x g で室温で3分間遠心分離します。miniprepキットを使用してDNAを単離します。残りの1.2 mLの培養液を4°Cで保存します。 DNAシーケンシングまたは診断制限酵素消化物により、正しいクローンを検証します。注:インサートのサンガーシーケンシングが推奨されますが、ITR による処理能力は標準的な方法では達成できません。ITR は、以下で説明するように制限酵素ダイジェストで検証する必要があります。 対応する抗生物質を含む50 mLのLBバッファーを滅菌250 mL三角フラスコに加えます。残りの培養液500 μLをフラスコに加え、OD600 が0.2〜0.5に達するまで30°C、180rpmで振とうします(~18時間)。バクテリアを50 mLのコニカルチューブに移し、3,000 x g、4°Cで20分間遠心分離します。 エンドトキシン低またはフリーのmidiprepキットを使用してDNAを単離します。 XmaI(またはSmaI)を用いて20 μLの診断制限酵素消化物でITRの完全性を確認します。500 ng プラスミド、0.5 μL の酵素、および 1 x バッファーを含む反応液を調製します。37°Cで1時間インキュベートします。 0.8%アガロースゲル上で反応を実行します。ITR が損なわれていない場合、消化により ~2.9 kb のバンドとカセットのサイズの別のバンドが得られます。この明瞭なバンドが観察されない場合は、ITR が損なわれていない可能性があり、クローニングをやり直す必要があります。注:XmaI(またはSmaI)制限部位を含むプラスミド(ITRのプラスミドに加えて)は、ゲル上に追加のバンドが現れます。 図2:プライマー設計の代表例。 mScarlet導入遺伝子の順方向および逆方向プライマー設計(代表例)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 量 コンポーネント XのμL テンプレートDNA(25 ng) 1 μL Fプライマー(10μM) 1 μL Rプライマー(10μM) 1 μL dNTP(10 mM) 10 μL Phusionバッファー(5x) 1 μL Phusionポリメラーゼ XのμL 水 50 μL 最終巻 表1:PCR増幅試薬。 PCR反応を成功させるために必要な成分です。 歩 温度 時間 初期変性 98 °C 1 分 30サイクル 98 °C 10秒 プライマーのTm 30秒 72 °C 30秒/KB 最終延長 72 °C 10分 持つ 4 °C 無期限 表2:PCR増幅プログラミング。 PCR反応を成功させるために必要なサイクリングパラメータ。 量 コンポーネント XのμL PCR産物(1μg)またはpAAVプラスミド(3μg) 5 μL バッファ(10x) 1 μL EcoRI-HFの 1 μL NotI-HFの XのμL 水 50 μL 最終巻 表3:消化試薬。 消化反応を成功させるために必要な成分。 量 コンポーネント XのμL 挿入 (X ng) XのμL バックボーン(50 ng) 2 μL T4 DNAリガーゼバッファー(10個入り) 1 μL T4 DNAリガーゼ XのμL 水 20 μL 最終巻 表4:ライゲーション試薬。 ライゲーション反応を成功させるために必要な成分。 3. トリプルプラスミドトランスフェクションによるベクター作製 注:以下の値は、最終粗前処理量が 2 mL の 6 ウェルプレートの 1 ウェルに対して最適化されています。すべての値は、最終容量が 20 mL の 15 cm プレートの場合は 10 倍にスケールアップでき、最終容量が 500 μL の 24 ウェルプレートの場合は 4 倍にスケールダウンできます。 100 mgのPEI MAXを100 mLの蒸留水に溶解して、塩酸ポリエチレンイミン(PEI)MAXのストックを1 μg/μL作成します。NaOHでpHを7.1に調整します。0.22 μmフィルターで混合物をフィルター滅菌し、1 mLのアリコートを-20°Cで凍結して長期保存します。解凍後、試薬を4°Cで1ヶ月間保存します。 10%ウシ胎児血清(FBS)を添加した、予熱したダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM、4.5 g/Lグルコース、110 mg/Lピルビン酸ナトリウム)を入れた6ウェルプレートに、3 x 105 HEK293またはHEK293T細胞を播種します。37°C、5%CO2 に設定したインキュベーターで~75%-90%のコンフルエントに成長させます(図3)。注:ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)で培養した細胞は、ベクター産生収量を低下させることが観察されています。適切な滅菌技術を使用すると、P/Sを使用する必要がなくなるため、HEK293細胞を抗生物質20で培養しないことをお勧めします。下流の形質導入でP/Sが必要な場合は、収穫後の粗調製にP/Sを添加することをお勧めします。 2 mL チューブに、1.3 μg の pAAV2/2 (Rep/Cap、血清型 2)、1.3 μg の pAAV.GOI、2.6 μg の pAdΔF6、および無血清 (SF) DMEM (4.5 g/L グルコース、110 mg/L ピルビン酸ナトリウム) を含む混合物を合計容量 100 μL に調製します(簡便な計算については 、補足表 1 を参照)。 別のチューブにネガティブコントロールを調製し、pRep/Capを無関係なプラスミドに置き換えます。ネガティブコントロールは、まれではあるが、形質導入中に細胞をトランスフェクションできる可能性のある未包装のpAAV.GOIプラスミドを粗製剤に含んでいる。注:エンドトキシン低またはフリーのマキシプレップまたはミディプレッププラスミドは、トリプルトランスフェクションに最適であり、一般的にミニプレップDNAと比較して高い力価ベクターを生成しますが、ミニプレップDNAは手っ取り早く汚れた予備試験に使用できます。 プラスミド混合物に5.2 μLのPEI MAXを加えます。これは、1:1の比率のプラスミド:PEI混合物です。10に設定されたボルテックスミキサーで15〜7回パルスしてよく混ぜます。複数のベクター調製物が産生される場合は、ウェルを吸引するのに十分なタイミングを確保し、次のステップで反応を希釈するのに十分なタイミングを確保するために、1分間の時間間隔をずらして(すなわち、t=0分の調製1、t=0分の調製2、t=1分などのように)各プラスミド混合物にPEIを添加します。注:プラスミド:PEIの比率は1:1が最適であることが確認されています。ただし、個々のユーザーは、この比率を最適化して効率を最大化できます。PEI最適化の実行方法については、説明を参照してください( 補足表2も参照)。 各チューブを15分間正確にインキュベートし、1.9 mLのSF DMEM(4.5 g/Lグルコース、110 mg/Lピルビン酸ナトリウム)で反応を希釈し、最終容量を2 mLにします。2回静かにピペットで混ぜます。過剰混合はプラスミド/PEI複合体を破壊し、トランスフェクション効率を低下させます。 ウェルから培地を吸引し、プラスミド:PEI混合物をウェル側に穏やかに添加して、細胞の剥離を防ぎます。細胞を37°C、5%CO2で72時間インキュベートします。インキュベーション中の細胞の溶解と剥離は、rAAV産生の正常なプロセスです(図4)。 図3:トランスフェクションの準備ができているHEK293細胞。 トリプルプラスミドトランスフェクションに必要なHEK293細胞の理想的なコンフルエント(75%-90%)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図4:トランスフェクション後のHEK293細胞。 pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40、pAAV2/2、pAdΔF6、およびプラスミド:PEIの比率が1:1のトランスフェクションの前後1、2、または3日後のHEK293細胞の出現。スケールバー:400 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 4. 粗ベクター製剤の収穫 トランスフェクションした細胞のプレート全体を-80°Cで30分間凍結した後、37°Cで30分間解凍します。 合計3回の凍結/解凍サイクルを繰り返します。蓋を取り外さないでください—プレートは内部を無菌状態に保つ必要があります。プレートは、次のステップに進む準備ができるまで-80°Cのままにしておくことができます。注:加湿されていないインキュベーターは解凍に最適で、偶発的な汚染につながる可能性のあるプレートの外側の結露を最小限に抑えます。 層流フード内で、無菌技術を使用して次の2つのステップを実行します。ピペッティングで各ウェルを混合し、細胞の破壊を最大にします。ライセートを2 mLチューブに移し、室温で15,000 x gで15分間遠心分離し、細胞破片を除去します。 上清を新しい2 mLチューブに慎重に移します。この粗製剤は、滴定または精製なしですぐに使用できます。ベクターは、4°Cで数ヶ月間、または-20°Cで数年間保存できます。注:必要に応じて、DNase耐性粒子内のベクターゲノム(VG)の数を定量することにより、定量PCR(qPCR)によって力価を計算できます。そのため、力価はVG / mLの単位で与えられます。4°Cで数ヶ月間保存されたベクターは、ベクターがチューブ壁を凝集および/または結合し、調製物の力価を低下させる可能性があるため、使用前に再滴定する必要があります。 5. 形質導入 形質導入の期間に応じて、目的の細胞タイプ(例:Huh7)を96ウェルプレートに50%〜75%のターゲットコンフルエントでプレーティングします。コンフルエント度が高くなると、AAV形質導入効率が低下する可能性があります。 新しい細胞タイプでの形質導入のためにカプシドのパネルをテストするなど、用量が関係しないアプリケーションのために、粗調製物の力価を知らなくてもベクター(CMV.mScarletなど)を細胞に添加します。無血清(SF)培地中で粗調製を1:3に希釈して、アプリケーションに必要な最適な量のベクターを得ます。96ウェルプレートから培地を吸引し、50〜100μLの希釈粗製剤をウェルに加えます。細胞を37°C、5%CO2でインキュベートします。注:血清には、AAVベクターを中和し、形質導入効率を低下させる可能性のある抗体が含まれている場合があります。ただし、血清は、感受性細胞タイプの形質導入中に使用できます。 形質導入後48時間後にベクター(hpt)を除去し、予め温めたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を一度洗浄します。また、ベクターは、感受性の高い細胞タイプに対しては、2 hptという速さで除去し、血清含有培地と交換することができます。多くのアプリケーションでは、一晩インキュベーションを行って細胞を形質導入し、朝にウェルを新鮮な血清含有培地と交換します。Huh7やU2-OSなどの頑健な細胞タイプは、培地交換を必要としません。 細胞を4%パラホルムアルデヒド(PFA)に10分間固定して形質導入を終了します。また、用途に応じて種々の終結方法(例えば、溶解)を用いることができる。ほとんどの細胞タイプでは、ピーク発現は48 hptで発生するため、一般的な実験エンドポイントです。 6. 細胞種による形質導入法のばらつき 注:細胞の種類が異なれば、必要な培養条件も異なります。したがって、形質導入のためのベクターの添加は、細胞の種類のニーズに基づいて最適化する必要があります。以下は、代表的な結果に含まれる細胞タイプの非常に特異的な形質導入プロトコルであり、研究者が自分のニーズに合わせて試したい形質導入プロトコルのいくつかのバリエーションを示しています。 マウス小腸オルガノイドC57BL/6Jマウスの小腸陰窩調製からマウス小腸オルガノイド(mSIO)を誘導します。オルガノイドを90%基底膜マトリックスに包埋し、オルガノイド増殖培地(抗生物質なし)または形質導入前培地(50%Wnt3a馴化培地[オルガノイド増殖培地中のL Wnt-3A細胞を使用して社内で製造]、10 mMニコチン酸アミド、10 μM ROCK阻害剤、および2.5 μM CHIR99021)を含む24ウェルプレートで培養し、37°Cおよび5%CO2で形質導入する前に1継代(5〜7日)します。 形質導入前に、オルガノイドをD-PBSで洗浄し、ピペッティングで基底膜マトリックスドームを破壊し、オルガノイドを解離培地中で37°Cで10分間インキュベートし、さらにピペッティングすることで、オルガノイドを小細胞クラスターに解離します。 15 mM HEPESを含むDMEM/F-12に5Sを添加し、細胞クラスターを遠心分離チューブに移し、室温1000 x gで5分間遠心分離して細胞クラスターを回収して細胞解離プロセスを停止させます。 細胞クラスターを形質導入培地(10 μg/mLのポリブレンを含む形質導入前培地または10 μg/mLのポリブレンを含むオルガノイド増殖培地)に再懸濁し、48ウェルプレートに移し、続いて形質導入のためにCMV.mScarletを包装したAAV粗製剤を添加します。 プレートを600 x g 、37°Cで1時間遠心分離し、その後さらに37°Cで6時間インキュベートすることにより、オルガノイドの形質導入を行います。形質導入したオルガノイドを1.5 mLの微量遠心チューブに集め、室温で1000 x gで5分間遠心分離し、氷上に置いた。 上清を除去した後、形質導入したオルガノイドを90%基底膜マトリックス中の形質導入前培地またはオルガノイド増殖培地および20 μLの種子液滴を、予め温めたチャンバーカバーガラスの1つのウェルに再懸濁します。 インキュベーターで10分間インキュベートした後、液滴を350 μLの形質導入前培地またはオルガノイド増殖培地に包埋し、インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。形質導入後2〜5日で形質導入されたオルガノイドを共焦点顕微鏡でイメージングすることにより、形質導入効率を決定し、オルガノイドあたりの赤色蛍光細胞の割合を推定します。 BeWo細胞形質導入の24時間前に、ヒト胎盤絨毛癌BeWo細胞を96ウェルプレートのウェルあたり10,000細胞で播種します。CMV.mScarletを包装した粗AAV調製物を無血清F12-K BeWo培地中で1:1に希釈し、ウェルあたり総容量が50 μLになるまで希釈します。ウェルから培地を吸引し、ウェルあたり50 μLの希釈AAVと交換します。 細胞を37°Cで一晩(~18時間)インキュベートし、10Sを含むF12-K BeWo培地100 μLを添加して、総容量を150 μLにします。 細胞をさらに6時間インキュベートし、形質導入後合計24時間(hpt)します。 イメージングでは、生細胞をF12-K培地でHoechst色素で30分間染色した後、培地を10S、1xグルタマックスサプリメント、および1xピルビン酸ナトリウムサプリメントを含むフェノールフリーDMEMと交換してイメージングします。37°C、5%CO2のDAPI(Hoechstイメージング用)およびmCherry(mScarletイメージング用)フィルターセットを使用して、共焦点顕微鏡で生細胞イメージングを実施します。 Hepa1-6およびHuh7細胞形質導入の24時間前に、マウスのHepa1-6肝細胞とヒトHuh7肝細胞をDMEM(4.5 g / Lグルコース、110 mg / Lピルビン酸ナトリウム、10S)で96ウェルプレートのウェルあたり5,000細胞でプレートします。 CMV.mScarletを包装した原液AAV調製物50 μLを細胞に直接添加し、37°Cで48時間インキュベートします。細胞をPBSで一度洗浄し、4% PFAで固定し、Hoechst色素で10分間染色します。DAPI(ヘキストイメージング用)およびmCherry(mScarletイメージング用)フィルターセットを使用して、共焦点顕微鏡でイメージングを行います。 C2C12およびHSkMC細胞形質導入の72時間前に、未分化マウスC2C12筋芽細胞および未分化ヒト初代骨格筋細胞(HSkMC)筋芽細胞を96ウェルプレートのウェルあたり5,000細胞でプレートします。 C2C12筋芽細胞の場合はCMV.mScarletをDMEM(4.5 g/Lグルコース、Penn/Strep、20% FBS)で1:1に、HSkMC筋芽細胞の場合は骨格筋成長培地で、粗AAV製剤を希釈します。培地を分化培地に変更することにより、HSkMC筋芽細胞を筋管に分化させます。 筋芽細胞および筋チューブを希釈したAAV製剤中で37°Cで24時間インキュベートします。 生細胞をHoechst色素で10分間染色し、DAPI(Hoechstイメージング用)およびmCherry(mScarletイメージング用)フィルターセットを使用して共焦点顕微鏡でイメージングします。