Aus Fett gewonnene mesenchymale Stromazellen, die mit primären gemischten Gliazellen kokultiviert wurden, um Prionen-induzierte Entzündungen zu reduzieren
Summary
Aus Fett gewonnene mesenchymale Stromazellen (AdMSCs) haben starke immunmodulatorische Eigenschaften, die bei der Behandlung von Krankheiten, die mit Entzündungen verbunden sind, nützlich sind. Wir zeigen, wie murine AdMSCs und primäre gemischte Gliazellen isoliert und kultiviert, AdMSCs zur Hochregulierung entzündungshemmender Gene und Wachstumsfaktoren stimuliert, die Migration von AdMSCs bewertet und AdMSCs mit primär gemischten Prionen-infizierten Gliazellen co-kultiviert werden.
Abstract
Mesenchymale Stromazellen (MSCs) sind durch die Produktion von entzündungshemmenden Zytokinen, Chemokinen und Wachstumsfaktoren starke Regulatoren von Entzündungen. Diese Zellen zeigen die Fähigkeit, Neuroinflammation im Rahmen von neurodegenerativen Erkrankungen wie der Prionenkrankheit und anderen Proteinfehlfaltungsstörungen zu regulieren. Prionenkrankheiten können sporadisch, erworben oder genetisch bedingt sein; Sie können aus der Fehlfaltung und Aggregation des Prionproteins im Gehirn resultieren. Diese Krankheiten verlaufen ausnahmslos tödlich, und es gibt keine Behandlungsmöglichkeiten.
Eines der frühesten Anzeichen einer Krankheit ist die Aktivierung von Astrozyten und Mikroglia und die damit verbundene Entzündung, die vor der nachweisbaren Prionenaggregation und dem neuronalen Verlust auftritt. So können die entzündungshemmenden und regulatorischen Eigenschaften von MSCs zur Behandlung von Astrogliose bei Prionenkrankheit genutzt werden. Kürzlich haben wir gezeigt, dass aus Fett gewonnene MSCs (AdMSCs), die mit BV2-Zellen oder primären gemischten Gliazellen kokultiviert werden, Prionen-induzierte Entzündungen durch parakrine Signalwege reduzieren. In dieser Arbeit wird eine zuverlässige Behandlung mit stimulierten AdMSCs beschrieben, um die Prionen-induzierte Entzündung zu verringern.
Eine heterozygote Population von AdMSCs kann leicht aus murinem Fettgewebe isoliert und in Kultur expandiert werden. Die Stimulation dieser Zellen mit inflammatorischen Zytokinen verbessert ihre Fähigkeit, sowohl in Richtung Prionen-infiziertes Gehirnhomogenat zu wandern als auch als Reaktion darauf entzündungshemmende Modulatoren zu produzieren. Zusammen können diese Techniken verwendet werden, um das therapeutische Potenzial von MSCs bei Prioneninfektionen zu untersuchen und können für andere Proteinfehlfaltungen und neuroinflammatorische Erkrankungen angepasst werden.
Introduction
Gliaentzündungen spielen eine Schlüsselrolle bei einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen, darunter Parkinson, Alzheimer und Prionen. Obwohl die abnormale Proteinaggregation auf einen Großteil der Krankheitspathogenese und Neurodegeneration zurückgeführt wird, spielen Gliazellen auch eine Rolle bei der Verschlimmerung dieser Situation 1,2,3. Daher ist die gezielte Behandlung von glialinduzierten Entzündungen ein vielversprechender therapeutischer Ansatz. Bei der Prionenerkrankung faltet sich das zelluläre Prionprotein (PrPC) falsch zum krankheitsassoziierten Prionprotein (PrPSc), das Oligomere und Aggregate bildet und die Homöostase im Gehirn stört 4,5,6.
Eines der frühesten Anzeichen einer Prionenerkrankung ist eine Entzündungsreaktion von Astrozyten und Mikroglia. Studien, die diese Reaktion unterdrückten, entweder durch Entfernung von Mikroglia oder Modifikation von Astrozyten, haben im Tiermodellen im Allgemeinen keine Verbesserung oder Verschlechterung der Krankheitspathogenese gezeigt 7,8,9. Die Modulation der Gliaentzündung, ohne sie zu beseitigen, ist eine faszinierende Alternative als Therapeutikum.
Mesenchymale Stromazellen (MSCs) haben aufgrund ihrer Fähigkeit, Entzündungen auf parakrine Weise zu modulieren, die Bühne zur Behandlung einer Vielzahl von entzündlichen Erkrankungen übernommen 10,11. Sie haben die Fähigkeit gezeigt, zu Entzündungsherden zu wandern und auf Signalmoleküle in diesen Umgebungen zu reagieren, indem sie entzündungshemmende Moleküle, Wachstumsfaktoren, microRNAs und mehr sezernieren 10,12,13. Wir haben bereits gezeigt, dass MSCs, die aus Fettgewebe gewonnen werden (als AdMSCs bezeichnet), in der Lage sind, in Richtung Prionen-infiziertes Gehirnhomogenat zu migrieren und auf dieses Gehirnhomogenat zu reagieren, indem sie die Genexpression für entzündungshemmende Zytokine und Wachstumsfaktoren hochregulieren.
Darüber hinaus können AdMSCs die Expression von Genen verringern, die mit dem Kernfaktor-kappa B (NF-κB), der Pyrindomäne der Nod-like-Rezeptorfamilie, die den 3 (NLRP3)-Inflammasom-Signalweg enthält, und der Gliaaktivierung sowohl in BV2-Mikroglia als auch in primären gemischten Gliazellen 14 assoziiert sind. Hier stellen wir Protokolle zur Verfügung, wie sowohl AdMSCs als auch primäre gemischte Gliazellen aus Mäusen isoliert, AdMSCs zur Hochregulierung modulatorischer Gene stimuliert, die AdMSC-Migration bewertet und AdMSCs mit Prionen-infizierten Gliazellen co-kultiviert werden. Wir hoffen, dass diese Verfahren eine Grundlage für die weitere Erforschung der Rolle von MSCs bei der Regulierung glialinduzierter Entzündungen bei neurodegenerativen und anderen Erkrankungen bilden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit demonstrieren wir ein zuverlässiges und relativ kostengünstiges Protokoll zur Bewertung der Auswirkungen von aus Fett gewonnenen mesenchymalen Stromazellen (AdMSCs) auf die Verringerung der Prionen-induzierten Entzündung in einem Gliazellmodell. AdMSCs können leicht isoliert und in Kultur für den Einsatz in nur 1 Woche erweitert werden. Dieses Protokoll erzeugt konsistent eine heterologe Population von Zellen, die durch Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie Marker exprimieren, die mit denen von …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Lab Animal Resources für die Tierhaltung. Zu unseren Finanzierungsquellen für dieses Manuskript gehören der Boettcher Fund, der Murphy Turner Fund, das CSU College of Veterinary Medicine und der Biomedical Sciences College Research Council. Abbildung 2A, Abbildung 2C und Abbildung 3A wurden mit BioRender.com erstellt.
Materials
| 0.25% Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| 5 mL serological pipets | Celltreat | 229005B | |
| 6-well tissue culture plates | Celltreat | 229106 | |
| 10 cm cell culture dishes | Peak Serum | PS-4002 | |
| 10 ml serological pipets | Celltreat | 229210 | |
| 15 mL conical tubes | Celltreat | 667015B | |
| 50 mL conical tubes | Celltreat | 667050B | |
| BV2 microglia cell line | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| Cell lifter | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| Crystal violet | Electron Microscopy Sciences | 12785 | |
| Dispase | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| Essential amino acids | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Ethanol (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Peak Serum | PS-FB4 | Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory |
| Formaldehyde | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Glass 10 mL serological pipet | Corning | 7077-10N | |
| Hank’s Balances Salt Solution | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| Hemocytometer/Neubauer Chamber | Daigger | HU-3100 | |
| High Glucose DMEM | Cytiva | SH30022.01 | |
| low glucose DMEM containing L-glutamine | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024.FS | |
| non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| Paraformaldehyde (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicillin/streptomycin/neomycin | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| Phosphate buffered saline | Cytiva | SH30256.01 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D Systems | 485-MI | |
| Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF | R&D Systems | 410-MT | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later. |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Collagenase/Dispase mixture |
| Sterile, individually wrapped cotton swab | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm | Greiner Bio-One | 657641 |
Referências
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