Koroid pleksustaki genlerin hedefli yıkımı
Summary
Burada, diğer beyin bölgelerinde herhangi bir etkiden kaçınırken koroid pleksustaki gen ekspresyonlarını seçici olarak değiştirmek için bir yöntem açıklıyoruz.
Abstract
Koroid pleksus (ChP), hem fizyolojik hem de patolojik koşullar altında merkezi sinir sistemine (MSS) immün hücre infiltrasyonu için kritik bir geçit görevi görür. Son araştırmalar, ChP aktivitesinin düzenlenmesinin CNS bozukluklarına karşı koruma sağlayabileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, diğer beyin bölgelerini etkilemeden ChP’nin biyolojik işlevini incelemek, hassas yapısı nedeniyle zordur. Bu çalışma, adeno-ilişkili virüsler (AAV’ler) veya TAT dizisinden (CRE-TAT) oluşan siklizasyon rekombinasyon enzimi (Cre) rekombinaz proteini kullanılarak ChP dokusunda gen yıkımı için yeni bir yöntem sunmaktadır. Sonuçlar, lateral ventriküle AAV veya CRE-TAT enjekte edildikten sonra, floresansın sadece ChP’de yoğunlaştığını göstermektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, çalışma, RNA interferansı (RNAi) veya X-overP1 (Cre / LoxP) sistemlerinin Cre / lokusu kullanılarak ChP’deki adenozin A2A reseptörünü (A2AR) başarılı bir şekilde yıktı ve bu yıkımın deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) patolojisini hafifletebileceğini gösterdi. Bu teknik, ChP’nin CNS bozukluklarındaki rolü üzerine gelecekteki araştırmalar için önemli etkilere sahip olabilir.
Introduction
Koroid pleksusun (ChP) genellikle beyin omurilik sıvısı (BOS) ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) salgılayarak beyin fonksiyonel homeostazının korunmasına yardımcı olduğu düşünülüyordu1,2. Son otuz yılda artan araştırmalar, CHP’nin merkezi sinir sistemine (CNS) bağışıklık hücresi infiltrasyonu için farklı bir yolu temsil ettiğini ortaya koymuştur.
Tek katmanlı bir ChP epitelinden oluşan ChP’nin sıkı bağlantıları (TJ’ler), makromoleküllerin ve bağışıklık hücrelerinin beyne girmesini önleyerek immünolojik homeostazı korur3. Bununla birlikte, belirli patolojik koşullar altında, ChP dokusu, BOS ve kandaki tehlikeyle ilişkili moleküler paternleri (DAMP’ler) algılar ve bunlara yanıt verir, bu da anormal bağışıklık infiltrasyonuna ve beyin işlev bozukluğunayol açar 4,5. Kritik rolüne rağmen, ChP’nin küçük boyutu ve beyindeki benzersiz konumu, diğer beyin bölgelerini etkilemeden işlevini incelemeyi zorlaştırır. Bu nedenle, özellikle ChP’de gen ekspresyonunu manipüle etmek, işlevini anlamak için ideal bir yaklaşımdır.
Başlangıçta, ChP’de eksprese edilen genlere özgü promotörlerin kontrolü altında Cre’yi eksprese eden siklizasyon rekombinasyon enzimi (Cre) transgenik hatları, floklanmış aday genlerleüreme yoluyla hedef genleri silmek için yaygın olarak kullanıldı 6,7,8. Örneğin, transkripsiyon faktörü Forkhead kutusu J1 (FoxJ1), yalnızca doğum öncesi fare beyninin7 ChP epitelinde eksprese edilir. Bu nedenle, FoxJ1-Cre çizgisi genellikle ChP 6,9’da bulunan genleri silmek için kullanıldı. Bununla birlikte, bu stratejinin başarısı büyük ölçüde destekleyicinin özgüllüğüne bağlıdır. FoxJ1’in beynin diğer bölümlerindeki ve periferik sistemdeki kirpikli epitel hücrelerinde de mevcut olması nedeniyle, FoxJ1 ekspresyon modelinin yeterince ayırt edici olmadığı yavaş yavaş keşfedildi7. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, floklanmış transgenik hatların ventriküllerine rekombinaz vermek için intraserebroventriküler (ICV) Cre rekombinaz enjeksiyonu yapıldı. Bu strateji, yalnızca ChP dokusunda tdTomato floresansının varlığı ile kanıtlandığı gibi yüksek özgüllük göstermiştir10,11. Bununla birlikte, bu yöntem hala floklanmış transgenik fare hatlarının mevcudiyeti ile sınırlıdır. Bu sorunu çözmek için araştırmacılar, ChP’ye özgü yıkımı veya hedef genlerin aşırı ekspresyonunu elde etmek için adeno-ilişkili virüsün (AAV) ICV enjeksiyonunu kullandılar12,13. ChP enfeksiyonu için farklı AAV serotiplerinin kapsamlı bir değerlendirmesi, AAV2/5 ve AAV2/8’in diğer beyin bölgelerini enfekte etmemekle birlikte CHP’de güçlü enfeksiyon yetenekleri sergilediğini ortaya koydu. Bununla birlikte, AAV2/8’in ventrikülleri çevreleyen ependimayı enfekte ettiği bulunurken, AAV2/5 grubunda enfeksiyon görülmedi14. Bu yöntem, floklanmış transgenik hayvanları edinme sınırlamalarının üstesinden gelme avantajına sahiptir.
Bu makale, iki yöntem kullanarak ChP’de gen yıkımı için adım adım bir protokolü açıklamaktadır: adenozin A2A reseptörünün (A 2A R) shRNA’sını taşıyan AAV2/5’in ICV’si ve A2AR’nin ChP’ye özgü yıkımını elde etmek için TAT dizisi (CRE-TAT) rekombinazından oluşan Cre rekombinaz proteini. Çalışma bulguları, CHP’de A2AR’nin yıkılmasının deneysel otoimmün ensefalomiyeliti (EAE) hafifletebileceğini düşündürmektedir. Bu ayrıntılı protokol, ChP fonksiyon çalışmaları ve ChP’deki genlerin spesifik yıkımı için yararlı rehberlik sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Araştırma, ChP genlerinin hedeflenen yıkımı için iki farklı yaklaşım sundu. İlk yaklaşım, Cre rekombinaz içeren CRE-TAT’ın A2AR flox/flox farelerine ICV enjeksiyonunu içeriyordu. İkinci yaklaşım, A2AR’nin shRNA’sını taşıyan AAV2/5’in ICV enjeksiyonunu gerektiriyordu. Bu iki stratejiyi kullanarak, çalışma ChP içinde A 2A R’nin seçici olarak yıkılmasını sağladı ve ChP’de A2AR sinyalini inhibe etmenin EAE patolojisi üzerindeki koruyucue…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’nın (31800903 No’lu Hibe, W. Zheng’e verildi) ve Wenzhou Bilim ve Teknoloji Projesi’nin (No. Y2020426, Y. Y. Weng’e verildi) bu çalışma için desteğini minnetle kabul ediyoruz.
Materials
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
Referências
- Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiological Reviews. 93 (4), 1847-1892 (2013).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews: Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
- Solar, P., Zamani, A., Kubickova, L., Dubovy, P., Joukal, M. Choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier in disease. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 35 (2020).
- Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
- Myung, J., et al. The choroid plexus is an important circadian clock component. Nature Communications. 9 (1), 1062 (2018).
- Zhang, Y., et al. A transgenic FOXJ1-Cre system for gene inactivation in ciliated epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (5), 515-519 (2007).
- Johansson, P. A., et al. The transcription factor Otx2 regulates choroid plexus development and function. Development. 140 (5), 1055-1066 (2013).
- Xu, H., et al. Choroid plexus NKCC1 mediates cerebrospinal fluid clearance during mouse early postnatal development. Nature Communications. 12 (1), 447 (2021).
- Spatazza, J., et al. Choroid-plexus-derived Otx2 homeoprotein constrains adult cortical plasticity. Cell Reports. 3 (6), 1815-1823 (2013).
- Zheng, W., et al. Choroid plexus-selective inactivation of adenosine A2A receptors protects against T cell infiltration and experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 52 (2022).
- Steffensen, A. B., et al. Cotransporter-mediated water transport underlying cerebrospinal fluid formation. Nature Communications. 9 (1), 2167 (2018).
- Zhu, L., et al. Klotho controls the brain-immune system interface in the choroid plexus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (48), E11388-E11396 (2018).
- Chen, X., et al. Different serotypes of adeno-associated virus vector- and lentivirus-mediated tropism in choroid plexus by intracerebroventricular delivery. Human Gene Therapy. 31 (7-8), 440-447 (2020).
- Konsman, J. P. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Psychoneuroendocrinology. 6 (28), 827-828 (2003).
- Weaver, A., et al. An elevated matrix metalloproteinase (MMP) in an animal model of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization. FASEB J. 19 (12), 1668-1670 (2005).
- Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5 (5), 4111 (2019).
- Kaiser, K., et al. MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus. Development. 148 (10), (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Reboldi, A., et al. C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17 cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE. Nature Immunology. 10 (5), 514-523 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., et al. Choroid plexus connexin 43 expression and gap junction flexibility are associated with clinical features of acute EAE. Annals of the New York Academy of Sciences. 1173, 75-82 (2009).
- Jovanova-Nesic, K., Jovicic, S., Sovilj, M., Spector, N. H. Magnetic brain stimulation upregulates adhesion and prevents Eae: MMP-2, ICAM-1, and VCAM-1 in the choroid plexus as a target. International Journal of Neuroscience. 119 (9), 1399-1418 (2009).
- Mills, J. H., Alabanza, L. M., Mahamed, D. A., Bynoe, M. S. Extracellular adenosine signaling induces CX3CL1 expression in the brain to promote experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 9, 193 (2012).
