To-foton kalsiumavbildning av forhjerneaktivitet i oppførsel av voksen sebrafisk
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å utføre to-foton kalsiumavbildning i dorsalforhjernen til voksen sebrafisk.
Abstract
Voksen sebrafisk (Danio rerio) utviser et rikt repertoar av atferd for å studere kognitive funksjoner. De har også en miniatyrhjerne som kan brukes til å måle aktiviteter på tvers av hjernegrupper gjennom optiske bildebehandlingsmetoder. Rapporter om registrering av hjerneaktivitet hos voksne sebrafisk som oppfører seg har imidlertid vært mangelvare. Denne studien beskriver prosedyrer for å utføre to-foton kalsiumavbildning i den dorsale forhjernen til voksen sebrafisk. Vi fokuserer på tiltak for å hindre voksne sebrafisk i å bevege hodet, noe som gir stabilitet som muliggjør laserskanning av hjerneaktiviteten. De hodebeherskede dyrene kan fritt bevege kroppsdelene sine og puste uten hjelpemidler. Prosedyren tar sikte på å forkorte tiden for hodestøtteoperasjon, minimere hjernens bevegelse og maksimere antall registrerte nevroner. Et oppsett for å presentere et oppslukende visuelt miljø under kalsiumavbildning er også beskrevet her, som kan brukes til å studere nevrale korrelater underliggende visuelt utløst atferd.
Introduction
Kalsiumfluorescensavbildning med genetisk kodede indikatorer eller syntetiske fargestoffer har vært en kraftig metode for å måle nevronaktivitet hos dyr som oppfører seg, inkludert ikke-menneskelige primater, gnagere, fugler og insekter1. Aktiviteten til hundrevis av celler, opptil ca. 800 μm under hjerneoverflaten, kan måles samtidig ved hjelp av multifotonavbildning 2,3. Aktiviteten til spesifikke celletyper kan også måles ved å uttrykke kalsiumindikatorer i genetisk definerte nevronpopulasjoner. Anvendelse av avbildningsmetoden for små virveldyrmodeller åpner for nye muligheter innen nevronberegning på tvers av hjernegrupper.
Sebrafisk er et mye brukt modellsystem i nevrovitenskapelig forskning. Larvesebrafisk rundt 6 dager etter befruktning har blitt brukt til kalsiumavbildning på grunn av deres miniatyrhjerne og gjennomsiktige kropp4. Juvenil sebrafisk (3-4 uker gammel) brukes også til å studere nevrale mekanismer som ligger til grunn for sensorimotoriske baner 5,6. Imidlertid er det maksimale ytelsesnivået for kompleks atferd, inkludert assosiativ læring og sosial atferd, nådd i en eldre alder 7,8. Dermed er det nødvendig med en pålitelig protokoll for å studere flere kognitive funksjoner i hjernen til voksne sebrafisk ved hjelp av avbildningsmetoder. Mens sebrafisklarver og unge sebrafisk kan bygges inn i agarose for in vivo-avbildning, lider voksen sebrafisk ved 2 måneder eller eldre av hypoksi under slike forhold og er fysisk for sterke til å holdes tilbake av agarose. Derfor er det nødvendig med en kirurgisk prosedyre for å stabilisere hjernen og gjøre det mulig for dyret å puste fritt gjennom gjellene.
Her beskriver vi en hodestøtteprotokoll som innebærer en ny utforming av en enkelt hodestang. Den reduserte operasjonstiden på 25 min er dobbelt så rask som den tidligere metoden9. Vi beskriver også utformingen av opptakskammeret (semi-sekskantet tank), hodetrinnet og en hurtiglåsmekanisme for å kombinere de to delene9. Til slutt beskrives også oppsettet for å presentere en oppslukende visuell stimulans for å studere visuelt utløst hjerneaktivitet og atferd. Samlet sett kan prosedyrene beskrevet her brukes til å utføre to-foton kalsiumavbildning i genetisk definerte cellepopulasjoner i en hodebehersket voksen sebrafisk, noe som muliggjør undersøkelse av hjerneaktiviteter under ulike atferdsparadigmer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en detaljert protokoll for å begrense hodet til voksen sebrafisk for to-foton kalsiumavbildning. Det er to kritiske trinn for å oppnå en hodestøtte som er stabil nok til laserskanning. Først må hodestangen limes til de spesifikke festestedene til hodeskallene. Andre deler av skallen er ofte for tynne til å gi mekanisk stabilitet og kan til og med bli brukket under sterke kroppsbevegelser. For det andre må huden over festestedene fjernes grundig. Restvann bør også tørkes grundig. Dette gjør at…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Institute of Molecular Biology, Academia Sinica og National Science and Technology Council, Taiwan. Maskinverkstedet ved Institutt for fysikk, Academia Sinica, hjalp til med å produsere spesialdesignede deler. Vi vil også takke P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Sveits) for utformingen av hurtiglåsmekanismen til hovedtrinnet.
Materials
| Acquisition card | MBF Bioscience | Vidrio vDAQ | Microscope |
| Back-projection film | Kimoto | Diland screen – GSK | present visual stimulus |
| Band-pass filter (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Base plate for the semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Camera filter (<875 nm) | Edmund optics | #86-106 | Behavior recording |
| Camera filter (>700 nm) | Edmund optics | #43-949 | Behavior recording |
| Camera lens | Thorlabs | MVL50M23 | Behavior recording |
| Chameleon Vision-S | Coherent | Vision-S | Laser |
| Circular plate for the head stage | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Controller for piezo actuator | Physik Instrumente | E-665. CR | Microscope |
| Current amplifier | Thorlabs | TIA60 | Microscope |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | Q-6 | Surgery: UV lamp |
| Emission Filter 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Head bar | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Infrared light | Thorlabs | M810L3 | Behavior recording |
| LED projector | AAXA | P2B LED Pico Projector | present visual stimulus |
| Moist paper tissue (Kimwipe) | Kimtech Science | 34155 | Surgery: moist paper tissue |
| Motorized XY sample stage | Zaber | X-LRM050 | Microscope |
| Neutral Density Filters (50% Transmission) | Thorlabs | NE203B | present visual stimulus |
| Ø1/2" Post Holder | ThorLabs | PH1.5V | Surgery: hollow tube for cannon |
| Ø1/2" Stainless Steel Optical Post | ThorLabs | TR150/M | Surgery: fish loading module |
| Objective lens 16x, 0.8NA | Nikon | CF175 | Microscope |
| Oil-based modeling clay | Ly Hsin Clay | C4086 | Surgery: head bar holder |
| Optical adhesive | Norland Products | NOA68 | Surgery: UV curable glue |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H11706P-40 | Microscope |
| Piezo actuator | Physik Instrumente | P-725.4CA PIFOC | Microscope |
| Pockels Cell | Conoptics | M350-80-LA-BK-02 | Microscope |
| Red Wratten filter (> 600 nm) | Edmund optics | #53-699 | present visual stimulus |
| Resonant-Galvo Scan System | INSS | RGE-02 | Microscope |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | RA90/M | Surgery: fish loading module |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | SWC/M | Surgery: fish loading module |
| ScanImage | MBF Bioscience | Basic version | Microscope |
| Semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Super-Bond C&B Kit | Sun Medical Co. | Super-Bond C&B | Surgery: dental cement |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Surgery: anesthetic |
| USB Camera | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Behavior recording |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Surgery: tissue glue |
Referências
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit neuroscience in zebrafish. Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).
- Kappel, J. M., et al. Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit. Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).
- Bartoszek, E. M., et al. Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).
- Buske, C., Gerlai, R. Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish. Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).
- Huang, K. H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
- Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).
- Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -. S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP). Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).
- Torigoe, M., et al. Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).
