Imagem de cálcio de dois fótons da atividade do prosencéfalo em peixes-zebra adultos com comportamento
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para realizar imagens de cálcio de dois fótons no prosencéfalo dorsal de zebrafish adultos.
Abstract
O peixe-zebra adulto (Danio rerio) exibe um rico repertório de comportamentos para o estudo das funções cognitivas. Eles também têm um cérebro em miniatura que pode ser usado para medir atividades em regiões cerebrais por meio de métodos de imagem óptica. No entanto, relatos sobre o registro da atividade cerebral em peixes-zebra adultos têm sido escassos. O presente estudo descreve procedimentos para a realização de imagens de cálcio de dois fótons no prosencéfalo dorsal de zebrafish adultos. Nós nos concentramos em etapas para impedir que peixes-zebra adultos movam suas cabeças, o que fornece estabilidade que permite imagens de varredura a laser da atividade cerebral. Os animais com a cabeça contida podem mover livremente suas partes do corpo e respirar sem ajudas. O procedimento visa encurtar o tempo da cirurgia de apoio de cabeça, minimizar o movimento cerebral e maximizar o número de neurônios registrados. Uma configuração para apresentar um ambiente visual imersivo durante a imagem de cálcio também é descrita aqui, que pode ser usada para estudar correlatos neurais subjacentes a comportamentos desencadeados visualmente.
Introduction
A imagem por fluorescência do cálcio com indicadores codificados geneticamente ou corantes sintéticos tem sido um poderoso método de medir a atividade neuronal em animais com comportamento, incluindo primatas não humanos, roedores, aves e insetos1. A atividade de centenas de células, até aproximadamente 800 μm abaixo da superfície cerebral, pode ser medida simultaneamente por meio de imagens com múltiplos fótons 2,3. A atividade de tipos celulares específicos também pode ser medida pela expressão de indicadores de cálcio em populações neuronais geneticamente definidas. A aplicação do método de imagem para modelos de pequenos vertebrados abre novas possibilidades no campo da computação neuronal em regiões cerebrais.
O peixe-zebra é um sistema modelo amplamente utilizado em pesquisas em neurociência. Larvas de peixes-zebra em torno de 6 dias pós-fertilização têm sido utilizadas para imagens de cálcio devido ao seu cérebro em miniatura e corpo transparente4. Os peixes-zebra juvenis (3-4 semanas de idade) também são utilizados para estudar os mecanismos neurais subjacentes às vias sensório-motoras5,6. No entanto, o nível máximo de desempenho para comportamentos complexos, incluindo aprendizagem associativa e comportamentos sociais, é alcançado em idade mais avançada 7,8. Assim, um protocolo confiável é necessário para estudar múltiplas funções cognitivas no cérebro de peixes-zebra adultos usando métodos de imagem. Enquanto larvas de peixe-zebra e peixes-zebra juvenis podem ser incorporados em agarose para imagens in vivo, peixes-zebra adultos com 2 meses ou mais sofrem de hipóxia em tais condições e são fisicamente fortes demais para serem contidos pela agarose. Portanto, um procedimento cirúrgico é necessário para estabilizar o cérebro e permitir que o animal respire livremente através das brânquias.
Aqui, descrevemos um protocolo de apoio de cabeça que envolve um novo design de uma única barra de cabeça. O tempo cirúrgico reduzido de 25 min é duas vezes mais rápido que o método anterior9. Descrevemos também o projeto da câmara de gravação (tanque semi-hexagonal), do estágio principal e de um mecanismo de bloqueio rápido para combinar as duas partes9. Finalmente, a configuração para apresentar um estímulo visual imersivo para estudar a atividade e os comportamentos cerebrais desencadeados visualmente também é descrita. Em geral, os procedimentos descritos aqui podem ser usados para realizar imagens de cálcio de dois fótons em populações celulares geneticamente definidas em um peixe-zebra adulto contido na cabeça, permitindo a investigação de atividades cerebrais durante vários paradigmas comportamentais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para conter a cabeça de peixes-zebra adultos para imagens de cálcio de dois fótons. Há duas etapas críticas para obter um apoio de cabeça que seja estável o suficiente para imagens de varredura a laser. Primeiro, a barra da cabeça deve ser colada nos locais de fixação específicos dos crânios. Outras partes do crânio são muitas vezes muito finas para fornecer estabilidade mecânica e podem até ser fraturadas durante movimentos fortes do corpo. Em segundo lugar, a pel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto de Biologia Molecular, Academia Sinica, e Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia, Taiwan. A Oficina de Máquinas do Instituto de Física, Academia Sinica ajudou a fabricar peças personalizadas. Também queremos agradecer a P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basileia, Suíça) pelo projeto do mecanismo de bloqueio rápido do estágio principal.
Materials
| Acquisition card | MBF Bioscience | Vidrio vDAQ | Microscope |
| Back-projection film | Kimoto | Diland screen – GSK | present visual stimulus |
| Band-pass filter (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Base plate for the semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Camera filter (<875 nm) | Edmund optics | #86-106 | Behavior recording |
| Camera filter (>700 nm) | Edmund optics | #43-949 | Behavior recording |
| Camera lens | Thorlabs | MVL50M23 | Behavior recording |
| Chameleon Vision-S | Coherent | Vision-S | Laser |
| Circular plate for the head stage | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Controller for piezo actuator | Physik Instrumente | E-665. CR | Microscope |
| Current amplifier | Thorlabs | TIA60 | Microscope |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | Q-6 | Surgery: UV lamp |
| Emission Filter 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Head bar | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Infrared light | Thorlabs | M810L3 | Behavior recording |
| LED projector | AAXA | P2B LED Pico Projector | present visual stimulus |
| Moist paper tissue (Kimwipe) | Kimtech Science | 34155 | Surgery: moist paper tissue |
| Motorized XY sample stage | Zaber | X-LRM050 | Microscope |
| Neutral Density Filters (50% Transmission) | Thorlabs | NE203B | present visual stimulus |
| Ø1/2" Post Holder | ThorLabs | PH1.5V | Surgery: hollow tube for cannon |
| Ø1/2" Stainless Steel Optical Post | ThorLabs | TR150/M | Surgery: fish loading module |
| Objective lens 16x, 0.8NA | Nikon | CF175 | Microscope |
| Oil-based modeling clay | Ly Hsin Clay | C4086 | Surgery: head bar holder |
| Optical adhesive | Norland Products | NOA68 | Surgery: UV curable glue |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H11706P-40 | Microscope |
| Piezo actuator | Physik Instrumente | P-725.4CA PIFOC | Microscope |
| Pockels Cell | Conoptics | M350-80-LA-BK-02 | Microscope |
| Red Wratten filter (> 600 nm) | Edmund optics | #53-699 | present visual stimulus |
| Resonant-Galvo Scan System | INSS | RGE-02 | Microscope |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | RA90/M | Surgery: fish loading module |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | SWC/M | Surgery: fish loading module |
| ScanImage | MBF Bioscience | Basic version | Microscope |
| Semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Super-Bond C&B Kit | Sun Medical Co. | Super-Bond C&B | Surgery: dental cement |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Surgery: anesthetic |
| USB Camera | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Behavior recording |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Surgery: tissue glue |
Referências
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