Imaging del calcio a due fotoni dell'attività del prosencefalo nel comportamento del pesce zebra adulto

L’imaging a fluorescenza del calcio con indicatori geneticamente codificati o coloranti sintetici è stato un potente metodo per misurare l’attività neuronale negli animali comportamentali, inclusi primati non umani, roditori, uccelli e^insetti. L’attività di centinaia di cellule, fino a circa 800 μm sotto la superficie cerebrale, può essere misurata simultaneamente utilizzando l’imaging multi-fotone ^2,3. L’attività di specifici tipi cellulari può anche essere misurata esprimendo indicatori di calcio in popolazioni neuronali geneticamente definite. L’applicazione del metodo di imaging per modelli di piccoli vertebrati apre nuove possibilità nel campo del calcolo neuronale in tutte le regioni del cervello.

I pesci zebra sono un sistema modello ampiamente utilizzato nella ricerca neuroscientifica. Le larve di pesce zebra a circa 6 giorni dopo la fecondazione sono state utilizzate per l’imaging del calcio a causa del loro cervello in miniatura e del corpo trasparente⁴. I giovani pesci zebra (3-4 settimane di vita) sono utilizzati anche per studiare i meccanismi neurali alla base delle vie sensomotorie ^5,6. Tuttavia, il livello massimo di prestazione per i comportamenti complessi, compreso l’apprendimento associativo e i comportamenti sociali, viene raggiunto a un’età più avanzata^{di 7,8} anni. Pertanto, è necessario un protocollo affidabile per studiare molteplici funzioni cognitive nel cervello del pesce zebra adulto utilizzando metodi di imaging. Mentre la larva di zebrafish e il pesce zebra giovane possono essere incorporati nell’agarosio per l’imaging in vivo, il pesce zebra adulto di 2 mesi o più soffre di ipossia in tali condizioni e sono fisicamente troppo forti per essere trattenuti dall’agarosio. Pertanto, è necessaria una procedura chirurgica per stabilizzare il cervello e consentire all’animale di respirare liberamente attraverso le branchie.

Qui, descriviamo un protocollo di poggiatesta che prevede un nuovo design di una singola barra per la testa. Il tempo di intervento ridotto di 25 minuti è due volte più veloce rispetto al metodo^{precedente 9}. Descriviamo anche il design della camera di registrazione (serbatoio semi-esagonale), lo stadio di testa e un meccanismo di bloccaggio rapido per combinare le due parti⁹. Infine, viene anche descritta la configurazione per presentare uno stimolo visivo immersivo per studiare l’attività cerebrale e i comportamenti attivati visivamente. Nel complesso, le procedure qui descritte possono essere utilizzate per eseguire l’imaging del calcio a due fotoni in popolazioni cellulari geneticamente definite in un pesce zebra adulto con la testa trattenuta, consentendo lo studio delle attività cerebrali durante vari paradigmi comportamentali.