Identificación de péptidos de pequeñas vesículas extracelulares a partir de macrófagos derivados de la médula ósea
Summary
Este protocolo describe un procedimiento para aislar pequeñas vesículas extracelulares de macrófagos mediante ultracentrifugación diferencial y extraer el peptidomo para su identificación por espectrometría de masas.
Abstract
Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) suelen ser secretadas por la exocitosis de los cuerpos multivesiculares (MVB). Estas nanovesículas con un diámetro de <200 nm están presentes en diversos fluidos corporales. Estos sEV regulan diversos procesos biológicos como la transcripción y traducción de genes, la proliferación y supervivencia celular, la inmunidad y la inflamación a través de sus cargas, como proteínas, ADN, ARN y metabolitos. En la actualidad, se han desarrollado diversas técnicas para el aislamiento de los sEV. Entre ellos, el método basado en ultracentrifugación se considera el estándar de oro y se usa ampliamente para el aislamiento de vehículos eléctricos. Los péptidos son naturalmente biomacromoléculas con menos de 50 aminoácidos de longitud. Estos péptidos participan en una variedad de procesos biológicos con actividad biológica, como hormonas, neurotransmisores y factores de crecimiento celular. El peptidomo está destinado a analizar sistemáticamente péptidos endógenos en muestras biológicas específicas mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Aquí, introdujimos un protocolo para aislar sEVs por ultracentrifugación diferencial y extrajimos peptidoma para su identificación por LC-MS/MS. Este método identificó cientos de péptidos derivados de sEVs de macrófagos derivados de la médula ósea.
Introduction
Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) con un diámetro inferior a 200 nm están presentes en casi todos los tipos de fluidos corporales y son secretadas por todo tipo de células, incluyendo la orina, el sudor, las lágrimas, el líquido cefalorraquídeo y el líquido amniótico1. Inicialmente, los vehículos eléctricos se consideraron como receptáculos para la eliminación de desechos celulares, lo que llevó a una investigación mínima en la década siguiente2. Recientemente, cada vez hay más pruebas de que los sEV contienen proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y otros metabolitos específicos. Estas moléculas son transportadas a las células diana3, contribuyendo a la comunicación intercelular, a través de la cual participan en diversos procesos biológicos, como la reparación de tejidos, la angiogénesis, la inmunidad4 y la inflamación 5,6, el desarrollo tumoral y la metástasis 7,8,9, etc.
Para facilitar el estudio de los sEV, es imperativo aislarlos de muestras complejas. Se han desarrollado diferentes métodos de aislamiento de sEVs basados en las propiedades físicas y químicas de los sEVs, como su densidad, tamaño de partícula y proteínas marcadoras de superficie. Estas técnicas incluyen métodos basados en ultracentrifugación, métodos basados en el tamaño de partículas, métodos basados en captura de inmunoafinidad, métodos basados en precipitación de sEVs y métodos basados en microfluídica10,11,12. Entre estas técnicas, el método basado en la ultracentrifugación es ampliamente reconocido como el estándar de oro para el aislamiento de sEV y es la técnica más utilizada13.
Una cantidad creciente de evidencia sugiere la presencia de una multitud de péptidos biológicamente activos no descubiertos en los peptidomos de varios organismos. Estos péptidos contribuyen significativamente a numerosos procesos fisiológicos mediante la regulación del crecimiento, el desarrollo, la respuesta al estrés 14,15 y la transducción de señales16. El objetivo del peptidomo de los sEV es descubrir los péptidos transportados por estos sEV y proporcionar pistas sobre sus funciones biológicas. Aquí, presentamos un protocolo de aislamiento de sEVs a través de ultracentrifugación diferencial, seguido de la extracción de péptidos de estos sEVs para un análisis más detallado de su peptidoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al investigar la función de los sEV, es imperativo obtener sEV de alta pureza a partir de muestras biológicas complejas para evitar cualquier contaminación potencial. Se han desarrollado una variedad de métodos para el aislamiento de los sEV13, y entre estos métodos, los métodos basados en la ultracentrifugación diferencial han demostrado una pureza relativamente alta de los sEV. En este estudio, se recolectaron 200 mL de sobrenadante celular durante 6 h, y se obtuvieron alrededor de 200-30…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales de China (3157270). Agradecemos al Dr. Feng Shao (Instituto Nacional de Ciencias Biológicas, China) por proporcionar iBMDM.
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
Referências
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. Peptidome: Chaos or inevitability. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
