अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज से छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के पेप्टाइड्स की पहचान
Summary
यह प्रोटोकॉल अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा मैक्रोफेज से छोटे बाह्य पुटिकाओं को अलग करने और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचान के लिए पेप्टिडोम निकालने की प्रक्रिया का वर्णन करता है।
Abstract
छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं (एसईवी) को आमतौर पर मल्टीवेसिकुलर बॉडी (एमवीबी) के एक्सोसाइटोसिस द्वारा स्रावित किया जाता है। <200 एनएम के व्यास वाले ये नैनोवेसिकल्स शरीर के विभिन्न तरल पदार्थों में मौजूद होते हैं। ये एसईवी विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं जैसे जीन प्रतिलेखन और अनुवाद, सेल प्रसार और अस्तित्व, प्रतिरक्षा और सूजन को उनके कार्गो, जैसे प्रोटीन, डीएनए, आरएनए और मेटाबोलाइट्स के माध्यम से नियंत्रित करते हैं। वर्तमान में, एसईवी अलगाव के लिए विभिन्न तकनीकों का विकास किया गया है। उनमें से, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित विधि को सोने का मानक माना जाता है और एसईवी अलगाव के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। पेप्टाइड्स स्वाभाविक रूप से लंबाई में 50 से कम अमीनो एसिड के साथ बायोमैक्रोमोलेक्यूल होते हैं। ये पेप्टाइड्स जैविक गतिविधि के साथ विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं, जैसे हार्मोन, न्यूरोट्रांसमीटर और सेल विकास कारक। पेप्टिडोम का उद्देश्य तरल क्रोमैटोग्राफी-टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) द्वारा विशिष्ट जैविक नमूनों में अंतर्जात पेप्टाइड्स का व्यवस्थित रूप से विश्लेषण करना है। यहां, हमने अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एसईवी को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश किया और एलसी-एमएस / एमएस द्वारा पहचान के लिए पेप्टिडोम निकाला। इस विधि ने अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज से सैकड़ों एसईवी-व्युत्पन्न पेप्टाइड्स की पहचान की।
Introduction
200 एनएम से कम व्यास वाले छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाएं (एसईवी) लगभग सभी प्रकार के शरीर के तरल पदार्थों में मौजूद होती हैं और मूत्र, पसीना, आँसू, मस्तिष्कमेरु द्रव और एमनियोटिक द्रवसहित सभी प्रकार की कोशिकाओं द्वारा स्रावित होती हैं। प्रारंभ में, एसईवी को सेलुलर कचरे के निपटान के लिए सेप्टेकल्स के रूप में माना जाता था, जिसके कारण बाद के दशक2 में न्यूनतम शोध हुआ। हाल ही में, बढ़ते सबूत इंगित करते हैं कि एसईवी में विशिष्ट प्रोटीन, लिपिड, न्यूक्लिक एसिड और अन्य मेटाबोलाइट्स होते हैं। इन अणुओं को लक्षित कोशिकाओं3 में ले जाया जाता है, जो अंतरकोशिकीय संचार में योगदान करते हैं, जिसके माध्यम से वे विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं, जैसे ऊतक की मरम्मत, एंजियोजेनेसिस, प्रतिरक्षा4 और सूजन5,6, ट्यूमर विकास और मेटास्टेसिस 7,8,9, आदि।
एसईवी के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने के लिए, जटिल नमूनों से एसईवी को अलग करना अनिवार्य है। एसईवी के भौतिक और रासायनिक गुणों के आधार पर विभिन्न एसईवी अलगाव विधियों को विकसित किया गया है, जैसे कि उनका घनत्व, कण आकार और सतह मार्कर प्रोटीन। इन तकनीकों में अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित विधियां, कण आकार-आधारित विधियां, इम्यूनोफिनिटी कैप्चर-आधारित विधियां, एसईवी वर्षा-आधारित विधियां और माइक्रोफ्लुइडिक्स-आधारित विधियां10,11,12 शामिल हैं। इन तकनीकों में, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित विधि को व्यापक रूप से एसईवी अलगाव के लिए स्वर्ण मानक के रूप में मान्यता प्राप्त है और यह सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकहै।
सबूतों की बढ़ती मात्रा विभिन्न जीवों के पेप्टिडोम में अज्ञात जैविक रूप से सक्रिय पेप्टाइड्स की एक भीड़ की उपस्थिति का सुझाव देती है। ये पेप्टाइड्स विकास, विकास, तनाव प्रतिक्रिया14,15 और सिग्नल ट्रांसडक्शन16 को विनियमित करके कई शारीरिक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण योगदान देते हैं। एसईवी के पेप्टिडोम का उद्देश्य इन एसईवी द्वारा किए गए पेप्टाइड्स को उजागर करना और उनके जैविक कार्यों के लिए सुराग प्रदान करना है। यहां, हम अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से एसईवी को अलग करने का एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, इसके बाद उनके पेप्टिडोम के आगे के विश्लेषण के लिए इन एसईवी से पेप्टाइड्स का निष्कर्षण होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एसईवी के कार्य की जांच करते समय, किसी भी संभावित संदूषण से बचने के लिए जटिल जैविक नमूनों से उच्च शुद्धता वाले एसईवी प्राप्त करना अनिवार्य है। एसईवी अलगाव के लिए विभिन्न तरीकोंको विकसित किया ग?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह अध्ययन चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (3157270) के अनुदान द्वारा समर्थित था। हम आईबीएमडीएम प्रदान करने के लिए डॉ फेंग शाओ (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बायोलॉजिकल साइंसेज, चीन) को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
Referências
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. Peptidome: Chaos or inevitability. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
