Испытание на одноосное сжатие поясничного позвонка мыши с заделкой нагружающей поверхности
Summary
В этом протоколе описаны два подхода, позволяющие сделать одноосное компрессионное тестирование поясничных позвонков мышей более достижимым. Во-первых, описывается преобразование трехточечного гибочного станка в станок для испытания на сжатие. Во-вторых, для поясничных позвонков мышей адаптирован метод подготовки нагружающей поверхности с использованием костного цемента.
Abstract
Растет осведомленность о том, что кортикальная и губчатая кость различаются в регулировании и ответе на фармацевтическую терапию, гормональную терапию и другие методы лечения возрастной потери костной массы. Трехточечное сгибание является распространенным методом, используемым для оценки влияния лечения на область среднего диафиза длинных костей, которая богата кортикальной костью. Испытание позвонков мышей на одноосную компрессию, хотя и позволяет оценить кости, богатые губчатой костью, реже проводится из-за технических проблем. Еще реже проводится сочетание трехточечных испытаний на изгиб и компрессию, чтобы определить, как лечение может одинаково или по-разному повлиять на область среднего диафиза длинной кости и центр позвонка. Здесь мы опишем две процедуры, позволяющие сделать испытание на сжатие поясничных позвонков мыши менее сложным методом, выполняемым параллельно с трехточечным изгибом: во-первых, процедуру преобразования трехточечного гибочного станка в машину для испытания на сжатие, и, во-вторых, метод встраивания для подготовки нагружающей поверхности поясничного позвонка мыши.
Introduction
Возрастные изменения костей широко признаны проблемными из-за повышенного риска переломов костей, связанных с этими изменениями. Переломы костей у людей могут приводить к хронической боли, ограничению подвижности, длительной инвалидности, повышенному риску смерти и экономическому бремени1. Распространенные методы лечения, исследованные для устранения симптомов возрастных изменений костей, включают пищевые добавки, гормональное лечение и лекарства 2,3,4,5,6,7,8,9. Первоначальные исследования таких методов лечения на людях обычно проводятся с использованием моделей мелких животных (например, лабораторных крыс и мышей), которые обладают двумя основными типами костей, обнаруженных в человеческом скелете. Аппендикулярные длинные кости, такие как плечевая, бедренная и большеберцовая кости, богаты кортикальной (т.е. компактной) костью, тогда как позвонки богаты губчатой костью (т.е. т.е. т.е. тканой, губчатой или трабекулярной костью)4. Появляется все больше знаний о том, что механизмы костной регуляции и сигнальные пути различаются между кортикальной костью (например, длинная кость в середине диафиза) и губчатой костью (например, центр позвонка)2. Из-за этого терапия может иметь дифференцированные эффекты, специфичные для кости или даже для конкретного места в пределах одной и той же кости 2,3,4.
Приложение силы к объекту (например, кости) приводит к тому, что объект претерпевает ускорение, деформацию или и то, и другое, в зависимости от граничных условий объекта. Когда кость стеснена, противоположная сила равной величины сопротивляется ускорению кости, и происходит деформация. По мере того, как кость подвергается деформации, возникает внутреннее сопротивление, называемое напряжением, которое бывает двух основных типов: нормальная сила в форме растяжения или сжатия и поперечная сила10. Часто образуется комбинация основных видов напряжений, в зависимости от приложенной системы сил10. Прочность материала – это его способность выдерживать нагрузки без сбоев. По мере того, как к материалу прикладываются все большие силы, он в конечном итоге подвергается остаточной деформации, и в этот момент говорят, что он перешел из упругого состояния (т.е. вернется к своей первоначальной форме, если сила будет устранена) в пластическое состояние (т.е. не вернется к своей первоначальной форме, если сила будет устранена)11. Точка, в которой происходит переход из упругого состояния в пластическое, называется пределом текучести. По мере того, как к материалу прикладываются еще большие силы, превышающие предел текучести, он все больше подвергается микротрещинам (т.е. повреждениям) до тех пор, пока не произойдет полное разрушение; На данный момент говорят, что материал провалился11,12. Перелом кости представляет собой разрушение как на структурном, так и на тканевом уровне10. Например, перелом позвоночной кости происходит не только из-за того, что несколько трабекул выходят из строя на структурном уровне, но и из-за разрушения элементов внеклеточного матрикса, таких как кристаллы коллагена и гидроксиапатита, в отдельной трабекуле на тканевом уровне.
Механические события, приводящие к разрушению материала, могут быть измерены с помощью различных методов испытаний. Трехточечная гибка является распространенным методом проверки механических свойств длинных костей аппендикулярного скелета. Этот метод прост и воспроизводим, что делает его предпочтительным методом биомеханического тестирования для многих исследователей13. Опуская траверсу на средний диафиз длинной кости, опирающейся на две нижние опорные балки, этот метод специально проверяет механические свойства области среднего диафиза, которая представляет собой плотно организованную кортикальную кость. По кривым нагрузки-перемещения можно определить, среди прочего, влияние силы растяжения на упругость, ударную вязкость, силу разрушения и переход от упругого к пластическому поведению костных материалов.
Во втором типе кости, называемом трабекулярной, губчатой, тканой или губчатой костью, костные элементы формируются в массив стержней и балок, называемых трабекулами, что придает им «губчатый» вид. Основные тела позвонков (т.е. центры) богаты губчатой костью и часто являются местами возрастных компрессионных переломов костей у людей14. Поясничные (т.е. поясничные) позвонки являются самыми крупными позвонками, несут большую часть веса тела и являются наиболее распространенным местом переломов позвонков15,16. Механические свойства тел позвонков лучше всего могут быть непосредственно оценены с помощью методов испытаний на одноосное сжатие, поскольку осевое сжатие представляет собой нормальную силовую нагрузку, оказываемую на позвоночные столбы in vivo17. Сжатие тел позвонков in vivo происходит в результате мышечных сокращений и связок, силы тяжести и сил реакции грунта18.
Испытание позвонков мелких животных на компрессию ex vivo может быть затруднено из-за их небольшого размера, неправильной формы и хрупкости. Форму тел позвонков можно оценить как параллелограмм с умеренным вентральным наклоном и небольшой вогнутостью черепа17. Такая форма создает трудности для проведения испытаний на одноосное сжатие ex vivo, поскольку без надлежащей подготовки к поверхности нагружения сжимающие силы будут приложены только к части поверхности нагружения, что приведет к «локальному контакту»17,19. Это может привести к противоречивым результатам и преждевременному выходу из строя19. Это не относится in vivo, потому что нагружающая поверхность окружена межпозвоночными дисками в позвоночных суставах, что позволяет распределять нагрузку по всей краниальной концевой пластине. Комплекс межпозвонково-краниальная концевая пластина играет важную роль в приложении силы по всему телу позвонка и биомеханике перелома тела позвонка14,20. Несмотря на то, что испытание на сжатие не является чем-то новым в области биологии, существуют ограничения в современных методах механического испытания костей. Эти ограничения включают в себя отсутствие предикторных моделей и симуляций для механики костей, уникальную геометрическую пространственную архитектуру и даже присущие биологические вариации на основе образцов21. Что еще более важно, эта область сталкивается с проблемами, связанными с отсутствием стандартизации между методами и общим отсутствием методов, описанных в литературе22.
В литературе описаны два метода подготовки поясничных позвонков грызунов для проведения испытаний на одноосную компрессию: метод разрезания и метод заделки 17,19,23,24,25,26. Метод разрезания требует, чтобы позвоночные отростки, краниальная концевая пластина и хвостовая концевая пластина были вырезаны из тела позвонка. Pendleton et al.19 ранее сообщали о подробном методе использования этого метода на поясничных позвонках мышей. Этот метод позволяет добиться идеально параллельных надрезов как на каудальной, так и на краниальной концевой пластине, а также избежать повреждения образца. Он также имеет ограничение, заключающееся в том, что краниальная концевая пластина удаляется. Краниальная концевая пластина содержит плотную оболочку кортикальной кости и играет важную роль в распределении нагрузок от межпозвоночных дисков in vivo и участвует в разрушении кости при переломах in vivo 17,20,27. В отличие от этого, метод встраивания включает в себя удаление позвоночных отростков с сохранением краниальной концевой пластинки тела позвонка нетронутой. Затем нагружающую поверхность делают примерно горизонтальной, помещая небольшое количество костного цемента на краниальный конец тела позвонка. Преимущество этого метода заключается в том, что он преодолевает технические проблемы, связанные с методом резки, и может лучше имитировать механизм приложения нагрузки и разрушения кости in vivo из-за сохранения краниальной концевой пластины. Этот подход ранее был задокументирован в исследованиях, включающих испытания на одноосное сжатие костей крыс. Однако, насколько нам известно, он ранее не был задокументирован в контексте поясничных позвонков мелких мышей 17,25,26. Метод, о котором идет речь, был ранее подробно описан Chachra et al.25 и первоначально использовал образец кости, удерживаемый между двумя пластинами, каждая из которых имела цилиндрическую полость, которая затем была заполнена полиметилметакрилатом (ПММА). Позже та же исследовательская группа усовершенствовала метод, при котором один конец аккуратно шлифуется (каудальный), а на другом конце добавляется небольшое пятно костного цемента (краниальный)26. Этот метод является улучшением предыдущего метода, поскольку он минимизирует материал между валиками и находится в центре внимания этой статьи. Несмотря на проблемы, связанные с одноосным тестом на компрессию позвонков, это метод, который может предоставить ценную информацию о влиянии предлагаемой терапии на кость, особенно в сочетании с трехточечным сгибанием.
Здесь демонстрируется использование трансформируемой трехточечной машины для испытаний на изгиб/сжатие, позволяющей легко испытывать как длинные кости, так и тела позвонков с помощью одной машины. Кроме того, представлено использование метода встраивания для одноосного испытания на компрессию поясничных позвонков мыши. Настоящее исследование было выполнено в рамках более крупного исследования, целью которого было изучение влияния пищевых добавок из семян конопли на свойства скелетной кости у молодых, растущих самок мышей C57BL/6 5,6. Тестер на трехточечный изгиб был первоначально сконструирован преподавателями и студентами инженерного факультета Университета штата Колорадо в Пуэбло и использовался нашей исследовательской группой для испытаний на трехточечный изгиб длинных костей [бедренная и большеберцовая кость крысы7 и плечевая, бедренная и большеберцовая кость мыши 5,6,8,9 ]. Тем не менее, его модификация и применение для использования в испытаниях на компрессию тела позвонков мышей не было изучено. Конструкция и конструкция трехточечного гибочного станка были описаны ранее7. В этом отчете основное внимание будет уделено методам, используемым для модификации машины для испытаний на сжатие и коррекции смещения системы. Во-вторых, описан метод встраивания для подготовки поверхности нагружения тела мыши, а также методы испытаний на одноосное сжатие и анализа данных о нагрузке-перемещении.
Protocol
Representative Results
Discussion
Целью настоящего исследования было описание конструкции трансформируемого трехточечного гибочного станка/машины для испытания на сжатие, а также использования метода заделки костного цемента из ПММА для подготовки образцов поясничных позвонков мышей перед испытанием на одноосное сжатие. Для образцов костей были получены и представлены описательные статистические данные, которые будут полезны для сравнения в будущих исследованиях. В настоящем исследовании были проанализированы некоторые из наиболее часто сообщаемых механических свойств цельной кости. Тем не менее, стоит отметить, что есть несколько дополнительных механических свойств на уровне целых костей и тканей, которые не были исследованы здесь.
Остается неясным, как механические свойства, полученные из образцов, приготовленных методом заделки, соотносятся с образцами, полученными методом вырезания поясничных позвонков мыши. Schumancher17 ранее оценивал механические свойства позвонков крыс, подготовленных с использованием двух различных методов, и обнаружил, что позвонки, подготовленные с использованием метода заделки, имели значительно меньшую жесткость, более высокое смещение текучести и более высокую деформацию текучести, чем образцы, приготовленные методом резания. Необходимы дальнейшие характеристики, чтобы понять, как сравниваются механические свойства позвонков мышей или других животных моделей при измерении с использованием двух различных методов подготовки поверхности нагрузки. Ожидается, что некоторые параметры различаются между позвонками, подготовленными разными методами, учитывая, что метод встраивания добавляет материал к образцу, но сохраняет концевую пластину, которая является важной структурой при переломах позвонков in vivo 17,27. Добавление костного цемента к краниальному концу увеличивает высоту образца, в то время как разрезание торцевых пластин удаляет высоту, изменяя соотношение сторон и, таким образом, изменяя механические свойства, такие как жесткость. Кроме того, несмотря на то, что ПММА более жесткий, чем губчатая кость позвонка, возможно, что ПММА претерпевает смещение, и степень этого смещения нуждается в дальнейшей характеристике. Кроме того, неясно, как результаты, полученные с помощью метода встраивания или метода вырезания, соотносятся с предсказаниями параметров костей с помощью конечно-элементного анализа для позвонков мыши, или как результаты изменяются при различных условиях (например, снижение скорости, различные уровни позвонков, состав ПММА). Тем не менее, поскольку все образцы готовятся одинаковым образом, этот метод является подходящим и позволяет легко и экономично проводить сравнения между группами лечения в одном исследовании, где образцы готовятся и тестируются в одинаковых условиях.
Что касается подготовки образцов перед испытанием на сжатие, очень важно подготовить образцы воспроизводимым образом. Одним из возможных ограничений метода, описанного в настоящем исследовании, является использование вращающегося инструмента для удаления позвоночных отростков. Другой метод удаления позвоночных отростков поясничных позвонков мышей был описан Pendleton et al.19, что может позволить провести более последовательную пробоподготовку. Кроме того, при применении костного цемента из ПММА могут возникнуть несоответствия. Поэтому важно применять костный цемент последовательно с точки зрения объема, размещения и времени затвердевания. Тем не менее, метод заделки может обеспечить более простой способ достижения последовательной пробоподготовки по сравнению с методом резки, поскольку может быть сложно добиться идеально ровных, параллельных разрезов между всеми образцами из-за их небольшого размера и хрупкости. В будущем потребуются исследования для оценки точности результатов, полученных из образцов, подготовленных с использованием метода встраивания по сравнению с другими методами. Способ резки.
Как уже упоминалось, необходимы дальнейшие характеристики и исследование метода встраивания для подготовки образцов поясничных позвонков мышей перед испытанием на одноосную компрессию. Тем не менее, данное исследование демонстрирует, что такой метод может быть использован, дает подробное описание предлагаемого метода и предлагает описательную статистику параметров, измеренных в образцах, подготовленных с использованием этого метода. Этот протокол представляет ценность для этой области из-за отсутствия в настоящее время доступной методологии. Более того, этот метод может лучше имитировать механизм возникновения переломов позвонков in vivo по сравнению с другими методами17,27. Преимущество метода также заключается в том, что он преодолевает технические трудности, связанные с другими методами, о которых сообщается в настоящее время, что делает испытание на одноосную компрессию более осуществимым при исследовании костей. Это особенно важно, потому что лекарственные препараты, диеты или другие вмешательства могут по-разному влиять на богатые корой кости (например, длинный средний диафиз) и богатые трабекуляром кости (например, тела позвонков), однако трехточечное сгибание является преобладающим методом оценки механических свойств костей13. Комбинация испытаний на трехточечный изгиб и одноосное сжатие может стать еще более достижимой благодаря использованию трансформируемой машины для испытания на трехточечный изгиб/сжатие. Таким образом, настоящее исследование предлагает два возможных способа сделать оценку как богатой корой, так и богатой трабекулярной костей в одном и том же исследовании более доступной для исследователей, что потенциально может привести к лучшему пониманию того, как данное лечение влияет на различные типы костей в экспериментальных группах.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны за значительные усилия, которые приложил инженерный факультет Университета штата Колорадо в Пуэбло при создании трехточечного гибочного станка и его модификации в трансформируемую трехточечную машину для испытаний на изгиб/сжатие. Мы особенно благодарны г-ну Полу Уоллесу, координатору механического цеха, за его усилия по планированию и осуществлению строительства и модификации машины. Опыт и отзывы д-ра Бахаа Ансафа (Университет штата Колорадо-Пуэбло, инженерный факультет) и д-ра Франциски Сандмайер (Университет штата Колорадо, Пуэбло, факультет биологии) также внесли значительный вклад в этот проект. Грант Института исследований каннабиса при Университете штата Колорадо в Пуэбло профинансировал более крупный проект, частью которого был этот эксперимент, и позволил приобрести мышей, реагенты и часть используемого оборудования.
Materials
| 120-Grit Sand Paper | N/A | N/A | For removal of caudal end plate soft tissues and irregularities |
| 24-bit Load Cell Interface | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | DQ-1000 | To connect load and displacement sensors to personal coputer |
| Base Mouse Diet | Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA | AIN-93G | Diet the mice were fed, without added hempseed |
| Diamond Cutoff Wheel w/ Rotary Tool | Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA | F0130200AK | To remove vertebral proccesses |
| Displacement Sensor | Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA | ID-S112EX | Displacement sensor with 0.001 mm resolution and 0.00305 mm accuracy |
| External Variable Voltage Power Source | Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA | 382213 | To provide power to compression testing machine |
| Female C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA | 027 (Strain Code) | Mouse model used in present study |
| Hempseed | Natera, Pitt Meadows, Canada | 670834012199 | Hempseed added to Base Mouse Diet |
| Igor Pro Software (Version 8.04) | Wave Metrics, Portland, Oregon, USA | N/A | Sofware used for load-displacement curve analysis |
| iLoad Mini Force Sensor | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | MFM-010-050-S | Load (force) sensor with 1.0% accuracy |
| Isotonic (0.9%) Saline Solution | N/A | N/A | To keep bone sampels hydrated |
| Leica EZ4 W Miscoscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | NC1601884 | For bone dissections and vertebral process removal |
| Microsoft Excel Software | Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA | N/A | For data transfer from SensorVue software |
| PALACOS R Bone Cement | Hareus Medical, Wehreim, Germany | 00-1112-140-01 | PMMA bone cement for embedding of the loading surface |
| Personal Computer | N/A | N/A | For data recording (see 24-bit Load Cell Interface, SensorVue Software, Microsoft Excel Software) and analysis (see Igor Pro Software) |
| SensorVue Software | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | N/A | Software used for real-time data collection during compression testing |
| Small Animal Dissecting Kit | N/A | N/A | Dissecting scissors, forceps, scalpel, blades, pins, gauze pads |
| Stainless Steel Top Platen (Self-Alligning) and Bottom Platen Pair | N/A | N/A | Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering |
| Three-Point Bending Machine | N/A | N/A | Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Refer to Sarper et al. (2014) for further details regarding construction |
Referências
- Kemmak, A. R., et al. Economic burden of osteoporosis in the world: A systematic review. Medical Journal of The Islamic Republic of Iran. 34, 153 (2020).
- Li, J., et al. Different bone remodeling levels of trabecular and cortical bone in response to changes in Wnt/β-catenin signaling in mice. Journal of Orthopaedic Research. 35 (4), 812-819 (2016).
- Crandall, C. Parathyroid hormone for treatment of osteoporosis. JAMA Internal Medicine. 162 (20), 2297-2309 (2002).
- Ott, S. M. Cortical or trabecular bone: what’s the difference. American Journal of Nephrology. 47 (6), 373-375 (2018).
- Sparks, C. A., Streff, H. M., Williams, D. W., Blanton, C. A., Gabaldón, A. M. Dietary hempseed decreases femur maximum load in a young female C57BL/6 mouse model but does not influence bone mineral density or micro-architecture. Nutrients. 14 (20), 4224 (2022).
- Blanton, C. A., Barrott, J. J., Kunz, K., Bunde, E., Streff, H. M., Sparks, C. A., et al. The Impact of Hempseed Consumption on Bone Parameters and Body Composition in Growing Female C57BL/6 Mice. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5839 (2022).
- Sarper, H., Blanton, C., Depalma, J., Melnykov, I. V., Gabaldón, A. M. Simulated weightlessness and synbiotic diet effects on rat bone mechanical strength. Life Sciences in Space Research. 3, 45-54 (2014).
- Choman, M. The Effect of a synbiotic diet on the structure and strength of cortical bone in aging male mice. , (2015).
- Sparks, C. A., Giltner, Z. T., Blanton, C. A., Gabaldón, A. M. The Effects of a synbiotic diet on humerus bone mineralization and mechanical strength in aging male mice. El Río. 4 (1), 3-12 (2021).
- Bilezikian, J. P., Martin, T. J., Clemens, T. L., Rosen, C. J. . Principles of bone biology (Fourth Edition). , (2019).
- Jepsen, K. J., et al. Establishing biomechanical mechanisms in mouse models: practical guidelines for systematically evaluating phenotypic changes in the diaphyses of long bones. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (6), 951-966 (2015).
- Vashith, D., Tanner, K. E., Bonfield, W. Contribution, development and morphology of microcracking in cortical bone during crack propagation. Journal of Biomechanics. 33 (9), 1169-1174 (2000).
- Turner, C. H., Burr, D. B. Basic biomechanical measurements of bone: A tutorial. Bone. 14 (4), 595-608 (1993).
- Warriner, A. H., et al. Which fractures are most attributable to osteoporosis. Journal of Clinical Epidemiology. 64 (1), 46-53 (2011).
- Donally, C. I., DiPompeo, C., Varcallo, M. . Vertebral compression fractires. , (2022).
- Alhadhoud, M., Alsiri, N. The epidemiology of spinal fractures in a level 2 trauma center in Kuwait. SAGE Open Medicine. 9, 1-11 (2021).
- Schumancher, Y. . Comparison of two loading surface preparation methods on rat vertebral bodies for compression testing. , (2013).
- Rathore, M., Sharma, D., Sinha, M., Siddiqui, A., Trivedi, S. A. Focused review – thoracolumbar spine: anatomy, biomechanics and clinical significance. Indian Journal of Clinical Anatomy and Physiology. 1 (1), 41-48 (2014).
- Pendleton, M. M., et al. High-precision method for cyclic loading of small-animal vertebrae to assess bone quality. Bone Reports. 9, 165-172 (2018).
- Lundon, K., Bolton, K. Structure and function of the lumbar intervertebral disk in health, aging, and pathologic conditions. Journal of Orthopaedic & Sports Physical Therapy. 31 (6), 291-306 (2011).
- Sharir, A., Barak, M. M., Shahar, R. Whole bone mechanics and mechanical testing. The Veterinary Journal. 177 (1), 8-17 (2008).
- Zhao, S., et al. Standardizing compression testing for measuring the stiffness of human bone. Bone & Joint Research. 7 (8), 524-538 (2018).
- Akhter, M. P., Jung, L. K. L. Decreased bone strength in HLA-B27 transgenic rat model of spondyloarthropathy. Rheumatology. 46 (8), 1258-1262 (2007).
- Shahnazari, M., et al. Higher doses of bisphosphonates further improve bone mass, architecture, and strength but not the tissue material properties in aged rats. Bone. 46 (5), 1267-1274 (2011).
- Chachra, D., Kasra, M., Vanin, C., MacLusky, N., Casper, R., Grynpas, M. The effect of different hormone replacement therapy regimens on the mechanical properties of rat vertebrae. Calified Tissue International. 56 (2), 130-134 (1995).
- Bushinsky, D. A., Willet, T., Asplin, J. R., Culbertson, C., Sara, C., Grynpas, M. Chlorthalidone improves vertebral bone quality in genetic hypercalciuric stone-forming rats. The Journal of Bone and Mineral Research. 26 (8), 1904-1912 (2011).
- Fujiwara, T., Akeda, K., Yamada, J., Kondo, T., Sudo, A. Endplate and intervertebral disc injuries in acute and single level osteoporotic vertebral fractures: is there any association with the process of bone healing. BMC Musculoskeletal Disorders. 20 (1), 336 (2019).
- Kalidindi, S. R., Abusafieh, A. Accurate characterization of machine compliance for simple compression testing. Experimental Mechanics. 37 (2), 210-215 (1997).
