嵌入加载面的小鼠腰椎单轴压缩测试

所有实验和方案均按照美国国立卫生研究院的《实验动物护理和使用指南》进行，并获得科罗拉多州立大学-普韦布洛机构动物护理和使用委员会的批准（协议编号：000-000A-021）。动物护理的详细程序先前已描述5,6。这些小鼠是在三周大时获得的，这是一项更广泛的研究的一部分，该研究旨在研究补充大麻籽的饮食对年轻，生长中的雌性C57BL / 6小鼠的影响（见材料表）。从 5 到 29 周龄，小鼠以三种饮食之一饲养：对照（0% 大麻籽）、50 g/kg （5%） 大麻籽或 150 g/kg （15%） 大麻籽，每组 8 只小鼠 5,6。在整个研究过程中，小鼠可以随意获取各自的饮食和水，成对饲养在聚碳酸酯笼中，并保持12小时的光照：12小时黑暗循环（从06：00到18：00开灯）。每周评估小鼠的体重和健康状况，所有小鼠都成功完成了研究，没有出现任何不良健康状况。在29周龄时，使用异氟醚气体对小鼠进行深度麻醉，并通过宫颈脱位实施安乐死5,6。在从胸骨到尾部的腹面做一个中线切口，并从尸体上取出所有胸内、腹膜和腹膜后器官。将内脏的尸体保存在-70°C的0.9%氯化钠溶液中，直到大约一年后进行骨解剖以进行椎骨测试。 1、三点折弯机改压试验机 拧下连接到三点折弯机7上的负载传感器的十字头梁（见材料表）（图1A，B）。 将自对准顶板拧到负载传感器上（参见 材料表），螺纹与十字头梁相同（图 1C）。 在每个下部支架上钻两个水平孔，稍后将连接底部压板（图 1D）。 将螺纹敲入不锈钢底板的两侧，以与下部支架上的钻孔对齐（图 1E）。 使用螺纹六角螺钉将底板固定到两个下部支架上并拧紧直至固定（图 1F）。注意： 六角螺钉的螺纹必须与下支架和顶部/底部压板上的螺纹孔相匹配。使用自对准顶板可能有助于实现顶板和负载表面之间的均匀接触，但考虑到椎体颅端的凹陷，这还不够。需要使用装载面处理方法进行进一步制备。在为小动物骨骼制造压缩试验机时，小动物骨骼比许多工业/工程材料更小、更弱，必须考虑负载传感器的负载能力和负载框架的尺寸。此外，应定期清洁和润滑机器，以确保准确的结果和平稳运行。 2.压缩试验机位移校正 在顶板和底板之间没有测试材料的情况下，将顶板降低到底板上，直到轻度接触（~0.3-0.5 N 预紧力）。 以恒定的下降速度（~1 mm/min）打开机器以开始压缩测试。使用数字数据采集软件（见 材料表）收集载荷 （N） 和位移 （mm） 测量值，用于机械测试的数据收集。注意：由于顶部和底部压板之间没有材料，因此观察到的所有位移都将是由于机器（Δx机器）（框架、称重传感器、压板、联轴器等）的位移造成的。 继续以恒定（即单调）速度将顶部压板降低到底部压板上，直到达到高于从所有骨样本中获得的力。 重复步骤 2.1 到 2.3，总共 3 次。 绘制系统位移（Δx机器，mm） 与施加的载荷（力，N）。 拟合数据的最佳拟合回归线（图 2A-D）。 在包含骨压迫测试数据的电子表格中，使用回归分析提供的方程来确定影响小鼠腰椎压迫测试数据点的记录位移（Δx总记录）的机器位移量（Δx机器）。注意：例如，考虑一个数据点，其中施加了 18 N 的力，并记录了 2.730 毫米的位移（记录的总位移为 Δx）。根据示例三阶多项式回归方程（图 2D）[Δx机器 = （4 × 10-7 x 施加的载荷3） – （8 × 10-5 x 施加的载荷2） + （0.0044 x 施加的载荷）]，记录的 0.056 mm 位移是由于机器位移（Δx机器）。记录的 Δx 总量 = Δx机器 + Δx试样 更正数据点的记录位移。注意：例如，请考虑上面的示例。如果记录 2.730 mm 的位移（记录的 Δx 总位移）和机器位移（Δx机器）占总位移的 0.056 mm，则感兴趣的标本（即骨骼）所经历的位移（Δx试样）为 2.664 mm。 因此，2.664 mm 是椎骨经历的实际位移（Δx试样），是用于载荷-位移曲线分析的值。Δx试样 = Δx总记录 – Δx机器 对每个标本（骨骼）收集的每个数据点重复步骤2.7-2.8。注意：此步骤很重要，因为在压缩测试过程中，观察到的位移不仅是由于试样的位移，而且观察到的位移是机器位移（Δx机器）（例如，框架、称重传感器、压板、联轴器等的压缩/位移）和试样（Δx试样).因此，对于发生相对少量位移的试样，例如小动物（例如小鼠）的试样，系统位移（Δx机器）会导致较大的误差。Kalidindi和 Abusafieh 28 之前报道了此处描述的校正系统位移的程序，除了此处描述的方法外，他们还详细介绍了另外两种方法。一些研究人员已经注意到使用不止一种方法来确定系统位移17。当对每台机器施加负载时，它可能会显示独特的模式和系统位移程度。因此，必须为每台机器确定系统位移校正系数，并且任何两台机器之间的系数都不相同。与椎骨的压缩测试相比，在测量系统位移时不会观察到较大的力减少，因为顶部和底部板之间没有材料。 3.从小鼠尸体中解剖第 5腰椎（L5） 在室温下解冻冷冻小鼠尸体，注意通过定期施用0.9%NaCl的等渗溶液来保持软组织和骨骼的水分。 在靠近尾巴根部的背中线的皮肤上做一个小切口（<0.5厘米），然后将切口延伸到每个后肢上，轻轻拉动以将毛皮从尾巴底部去除到动物的头部。 切掉腹壁肌肉组织，直到脊柱清晰可见。 在解剖显微镜下，观察两个骶髂关节和骶骨的颅端。 使用剃须刀片或手术刀进行细切，将最后一个腰椎 （L6） 与骶骨的颅端分开。 再次，在椎间隙之间切割，从脊柱中取出 L6 和 L5，留出 L5 进行分析（图 3）。 在解剖显微镜下检查椎骨，并从骨骼中取出所有软组织，包括椎间盘，主要使用纱布垫，必要时用镊子轻轻取出。注意：在本研究中，L5 被选为感兴趣的椎骨，但可以选择其他腰椎进行压缩测试。 4. 使用PMMA骨水泥包埋法制备L5椎体承压面进行单轴压缩试验 使用连接到旋转工具的金刚石切割轮（参见 材料表），在每个椎弓根处进行切割以去除横突和棘突（图 4）。如果留在中心，椎突可能导致与突起本身的上/下压板局部接触，而不是在整个中心分布负荷。 使用 120 粒度的细砂纸轻轻打磨椎骨的尾端（参见 材料表），以去除所有椎间盘、软组织和不规则处。 用永久性记号笔标记打磨过的尾端，以便日后识别。 根据制造商的说明混合PMMA骨水泥（见 材料表）。 在PMMA骨水泥仍处于半软状态的情况下，将少量骨水泥朝上放在椎骨的颅骨（无标记）端，确保在椎骨位于盐水浴中时覆盖整个表面，以保持骨样本的水分和凉爽。 在PMMA仍处于半软状态的情况下，将椎骨放在底板上，尾部（标记）面朝下（图5）。 打开机器以啮合驱动齿轮，然后慢慢将顶部压板降低到椎骨 + PMMA 骨水泥复合物上，直到与骨水泥接触并施加最小的力 （<0.5 N） 以将 PMMA 均匀分布在骨表面上。处于中立位置的顶板可以估计为水平，当压在半软 PMMA 上时，将导致 PMMA 填充椎骨颅端的凹陷，并在顶板下方形成平坦的水平表面。 将顶部压板轻轻按压PMMA骨水泥，让样品不受干扰地静置，直到PMMA骨水泥完全硬化（根据制造商对本研究中使用的PMMA骨水泥的说明~10分钟）。在此期间，将样品保存在盐水浴中或经常用生理盐水喷洒，以保持样品水分和凉爽。 一旦PMMA骨水泥完全硬化，就可以开始压缩测试。使用专为机械测试数据收集而设计的数字软件，将传感器的载荷（即力）（N）和位移（即挠度）（mm）数据实时收集到电子表格中（参见 材料表）。 在基线数据收集 5 秒后，以 <0.5 N 的最小预紧力施加，开始以单个（即单调）预定的下降速度将顶部压板降低到样品上，以开始压缩测试 （~1 mm/min）。 一旦观察到载荷 （N） 大幅降低，表明材料失效，就停止收集数据。注意： 制造商说明将指定 PMMA 骨水泥的大致硬化时间。PMMA骨水泥的硬化时间可能因所使用的PMMA骨水泥类型而异。按照制造商的说明确定 PMMA 硬化的等待时间。然而，作为PMMA骨水泥已经完全硬化的指标，可以与将放置在椎骨上的样品同时混合额外的PMMA骨水泥样品，但放在一边并检查它是否仍然柔软或完全硬化。如果完全硬化，这可能表明骨骼上的PMMA也完全硬化，而不会干扰骨骼+PMMA复合物。在整个PMMA硬化和测试期间，骨骼样本必须保持良好的水分和冷却。短短几分钟暴露在干燥的空气中就会导致生物力学特性的变化。一些研究人员使用配备盐水浴19的压缩试验机。在本研究中，压缩试验机没有盐水浴。取而代之的是，在整个PMMA硬化期和测试期间定期使用细小的盐水雾。 5. L5椎单轴受压试验载荷位移曲线分析 将电子表格中的载荷 （N） 和校正位移 （mm） 数据复制并粘贴到技术图形和数据分析软件中（参见 材料表）。 生成一个图形，其中载荷 （N） 位于 y 轴上，校正试样位移（Δx试样，mm）位于 x 轴上（图 6）。在软件中执行此操作，首先单击 Windows、 新建表，然后单击 Do it 以制作表。将原始数据电子表格中的校正位移 （mm） 和载荷 （N） 数据复制到新表中。 接下来，通过单击 “数据”生成一个波形来表示原始数据，然后单击“ XY 配对到波形” ，并为 X-Wave 选择校正的位移数据，并为 Y 波选择加载数据。确保“点数”框中的数据点数正确，命名波形，然后单击 “生成波形”。制作波形后，单击 “Windows”生成图形，然后单击“ 新建图形”，然后将波形放在 Y 轴上，并在 X 轴上“计算”。 使用光标工具在图形上标记感兴趣的点/区域进行分析。步骤 5.4-5.8（图 6）中提到了计算常见全骨机械性能的一些感兴趣的点/区域，包括 从工作到失效 （N x mm）、 最大载荷 （N）、 刚度 （N/mm）、 屈服载荷 （N） 和 屈服后位移 （mm）。 为了计算 工作到失效 （N x mm），在测试开始时放置一个光标 （A），在材料失效之前放置一个光标 （B）（即，在观察到负载大幅降低之前在测试期间达到的最大负载处）。注意：因此，光标 A-B 将从材料开始承受力并发生位移到材料失效的点的整个测试中括起来。 从工作到失败 （N x mm） 可以测量为曲线下方的总面积（即光标 A 和 B 之间的曲线下方面积）。 计算 最大载荷 （N） 作为在测试期间观察到的载荷的最高值（即光标 B 处的载荷）。 将材料的 刚度 （N/mm） 计算为线弹性区域的斜率（即光标 C 和 D 之间的斜率）。 屈服载荷 （N） 是载荷-位移曲线偏离线性并进入塑性区域的载荷，从而维持永久变形（即 D 点的载荷）。通过测量光标 D 处的载荷来计算。 屈服后位移 （mm） 是材料延展性的指标。将其测量为屈服点和材料失效点之间的位移（即光标 D 和 B 之间的位移）。注意：上面列出的参数只是报告的一些常见的全骨机械性能。它不是可以从载荷-位移曲线中获得的所有全骨机械性能的完整列表。其他全骨力学性能参数包括总位移 （mm）、吸收的弹性能 （N x mm）、弹性位移 （mm）、吸收的塑性能量 （N x mm） 和塑性位移 （mm） 等。此外，未列出组织水平的骨骼力学特性;这些需要使用特定的解剖测量值（例如骨直径）进行数据转换。 补充文件 1 中列出了从软件中的载荷-位移曲线进行测量的示例代码。