Une approche de vision industrielle pour les flux de travail de microscopie électronique à transmission, l’analyse des résultats et la gestion des données

L’interprétation des résultats expérimentaux de la TEM dépend souvent de nombreux paramètres expérimentaux interconnectés, tels que les réglages du microscope, les conditions d’imagerie et, dans le cas d’expériences operando ou in situ, les modifications de l’environnement ou des stimuli ^1,23. L’analyse précise de grands ensembles de données TEM, sur lesquels ces paramètres peuvent être continuellement modifiés, exige une attention particulière de la part de l’opérateur pour enregistrer avec précision chaque condition et chaque réglage pour chaque image dans un journal de laboratoire ou une autre source de documentation externe. À mesure que les ensembles de données de GDT gagnent en taille et en complexité, la tenue manuelle des dossiers devient ingérable et des informations clés peuvent être omises ou mal enregistrées. Le logiciel MVS décrit ici consolide les métadonnées générées au cours d’une expérience à partir du microscope, du détecteur/caméra et d’autres systèmes (tels que les porte-échantillons in situ) et les aligne avec leurs images respectives.

En plus de la consolidation des métadonnées, le logiciel applique des algorithmes de vision industrielle pour suivre et stabiliser le champ de vision grâce à une combinaison de corrections spatiales, de faisceaux et numériques à l’aide de ses fonctions Drift Correct et Focus Assist . Lorsque la fonction Drift Correct est activée, une image de « modèle » de corrélation croisée est générée à l’aide de la première image extraite dans le logiciel MVS. Le modèle est ensuite comparé aux images entrantes pour calculer la direction et l’ampleur de la dérive ou du mouvement de l’échantillon. Avec ces informations, le logiciel MVS applique automatiquement les corrections nécessaires pour conserver les caractéristiques de l’image au même endroit en ajustant au moins l’un des trois paramètres suivants: emplacement de la scène, déplacement du faisceau ou de l’image et correction d’image numérique. La fonction Focus Assist utilise une combinaison d’algorithmes pour attribuer une valeur de mise au point, appelée score de mise au point à chaque image, et ces scores sont comparés pour déterminer l’ampleur et la direction du réglage de la mise au point à appliquer pour maintenir la mise au point de l’échantillon. En mode d’imagerie STEM, le logiciel MVS tente de maximiser le contraste grâce à une version propriétaire de la variance normalisée pour attribuer le score de mise au point. En mode TEM, une somme radiale d’intensité est calculée dans la FFT et utilisée pour calculer le score de mise au point. La capacité du logiciel MVS à optimiser la mise au point est limitée lorsqu’il ne peut pas calculer avec précision le score de mise au point correct pour une image. Cela se produit généralement lorsque le microscope est mal aligné ou que l’échantillon est significativement flou pendant l’étalonnage, empêchant le logiciel de calculer correctement la valeur correcte du score de mise au point de départ. Le logiciel MVS peut avoir des difficultés à calculer le score de mise au point pour les échantillons avec des franges de réseau bien définies, car les franges de réseau dans la FFT peuvent « submerger » l’algorithme de notation de mise au point; Ainsi, si un échantillon sort de la mise au point, le score de mise au point peut ne pas refléter avec précision le changement de mise au point. Inversement, travailler à de faibles grossissements ou avec un échantillon qui a un signal FFT faible peut également rendre difficile le calcul d’un bon score de mise au point. Pour atténuer ces difficultés, le logiciel MVS contient un certain nombre d’algorithmes supplémentaires qui peuvent être sélectionnés par l’utilisateur pour calculer le score de mise au point si les paramètres par défaut ne conviennent pas à l’échantillon. Ceux-ci doivent être testés et appliqués au cas par cas pour déterminer les meilleurs algorithmes pour une expérience donnée.

Les changements morphologiques dans la structure de l’échantillon au fil du temps sont pris en compte à l’aide d’un facteur de morphing de modèle. Ce filtre est réglable par l’opérateur, de sorte que les algorithmes d’enregistrement tiennent compte des changements morphologiques au fil du temps. En outre, le logiciel surveille l’image continue, les paramètres du microscope et les paramètres de la caméra ou du détecteur pour mettre à jour automatiquement le modèle lorsqu’il est déclenché par des modifications de la structure de l’échantillon et après toute modification induite par l’opérateur des paramètres du microscope, de la caméra ou du détecteur. Comme le montrent la figure 4, la figure 5, le fichier supplémentaire 7 et le fichier supplémentaire 8, le logiciel MVS fournit une stabilisation efficace et immédiate, permettant une imagerie haute résolution d’échantillons en mouvement ou en changement dynamiques. Bien que le logiciel soit capable de contrôler des taux très élevés de dérive ou de mouvement d’échantillon, tels que ceux qui se produisent lors de l’application d’une rampe de chauffage au cours d’une expérience in situ, il existe des limites aux corrections de scène maximales ou aux déplacements de faisceau que le logiciel peut contrôler si l’échantillon se déplace ou dérive très rapidement. Cette limite est fonction du taux de mise à jour de l’image, de la taille du champ de vision et du taux de dérive. Pour un champ de vision et un taux de mise à jour de l’image donnés, il existe un taux de dérive maximal qui peut être corrigé, et si les mouvements physiques ne peuvent pas suivre, le processus peut se terminer ou devenir instable. À partir des modèles d’enregistrement générés lorsque des fonctionnalités telles que Drift Correct sont appliquées, des métadonnées calculées supplémentaires peuvent être générées. Par exemple, la corrélation de correspondance est un enregistrement numérique de l’ampleur du changement entre les modèles d’une série et est utilisée pour identifier les points d’une chronologie expérimentale dans laquelle l’échantillon a changé. Une valeur de corrélation de correspondance élevée correspond à un échantillon qui a subi des modifications de sa morphologie, et une valeur de corrélation de correspondance faible correspond à un échantillon dont la structure reste relativement statique. La corrélation de correspondance est particulièrement utile pour les études in situ car elle peut être tracée graphiquement, ce qui permet à l’utilisateur de localiser rapidement les images de la série correspondant à un changement significatif de l’échantillon. Il est important, cependant, de comprendre que des valeurs de corrélations de correspondance élevées peuvent également correspondre à des changements dans les conditions d’imagerie, tels que le déplacement de la scène ou la modification du grossissement, si ces actions sont effectuées alors que la fonction de correction de la dérive reste active.

Le flux de travail d’étalonnage présenté ici utilise un support d’étalonnage unique et une routine d’étalonnage semi-automatisée pour étalonner avec précision le faisceau dans diverses conditions de lentille avec une intervention minimale de l’opérateur. La routine d’étalonnage de la dose est accessible via le logiciel MVS installé sur le TEM. Le logiciel MVS lit automatiquement les paramètres pertinents du microscope pour enregistrer toutes les mesures à référence pour des expériences ultérieures. Sur certains TEM, il n’est pas possible de lire les réglages d’ouverture ou de monochromateur, et ceux-ci doivent être saisis dans les paramètres du logiciel MVS par l’opérateur pendant les étalonnages et pendant l’utilisation. Des rappels sont intégrés au logiciel pour vous aider à maintenir ces paramètres d’entrée de l’opérateur à jour en suivant les instructions du programme. Le développement d’un support avec un collecteur de courant intégré, plutôt que de s’appuyer sur un support intégré ailleurs dans la colonne du microscope, est un choix de conception délibéré. Cela permet au collecteur de courant d’être positionné sur le même plan qu’un échantillon, éliminant ainsi les erreurs de mesure du courant causées par la déviation du faisceau ou les différences dans l’absorption des électrons par les ouvertures à différentes positions du faisceau. Le logiciel MVS suit une routine automatisée pour mesurer le courant et la surface du faisceau pour toute combinaison de conditions de lentille. Le logiciel peut ensuite corréler ces étalonnages mesurés avec la caméra ou le courant de l’écran et extrapoler tout changement de grossissement, etc. à la surface du faisceau pendant l’expérience. Une fois générés, ces fichiers d’étalonnage peuvent être utilisés immédiatement et sont automatiquement enregistrés pour une utilisation ultérieure si le logiciel détecte les mêmes paramètres utilisés lors d’une session ultérieure. Bien que la longévité du fichier d’étalonnage varie d’un microscope à l’autre, les auteurs ont constaté qu’ils sont capables d’utiliser les mêmes fichiers d’étalonnage pendant plusieurs mois sans observer de changements substantiels aux valeurs actuelles. Il existe des routines intégrées surveillant le profil d’émission des armes à feu pour aider à maintenir la pertinence de ces étalonnages, en particulier sur les pistolets à émission FEG à froid.

La normalisation des mesures de dose entre les microscopes et le suivi automatisé de l’exposition du faisceau d’un échantillon sont des fonctions essentielles du logiciel MVS, car elles permettent des comparaisons quantitatives des conditions de dose entre les expériences à effectuer sur différents systèmes de microscope. La dégradation induite par la dose d’un échantillon de zéolite (ZSM-5), obtenue au cours d’expériences identiques utilisant différents microscopes, entraîne la disparition complète des taches FFT après une dose électronique cumulative ou seuil maximale (~60.000 e-/Å 2 lors de l’application d’un débit de dose de ~500 e^–/Ų·s) pour les deux configurations. Ces résultats comparatifs démontrent que le logiciel de dose facilite les mesures de dose quantitatives reproductibles. La petite différence dans la dose cumulée à laquelle la disparition complète du point FFT est observée pour chaque expérience est probablement le résultat des différentes tensions d’accélération utilisées par les deux microscopes, avec des tensions d’accélération plus faibles entraînant plus de voies de dommages par rayonnement, et des tensions d’accélération plus élevées entraînant généralement plus de dommages par knock-on²⁴. Les résultats de la littérature pour la dose critique de nanoparticules ZSM-5 vont de 9 000 à 14 000 e^–/Ų en utilisant les premières disparitions de taches FFT, plutôt que la disparition complète de toutes les taches FFT^25,26. Dans nos résultats, la première disparition du point FFT correspond à une dose cumulée d’environ 25 000 e^–/Ų. Les études précédentes se sont appuyées sur des mesures de courant obtenues à l’aide d’un écran au phosphore, ce qui est bien documenté pour sous-estimer les mesures de courant de faisceau par rapport à une tasse de Faraday¹⁵. La dose critique déterminée peut varier d’un facteur de deux ou plus, selon le pic de FFT utilisé pour suivre la dose. Cela indique que les fréquences spatiales plus élevées se dégradent en premier et peuvent entraîner des valeurs différentes en fonction de l’accès à la zone utilisée lors des mesures (nos résultats se sont concentrés sur les taches FFT du cristal de zéolite entier, plutôt que sur des caractéristiques structurelles spécifiques)^25,26. Ces différences dans les techniques et l’étalonnage actuel expliquent la différence de valeurs entre les deux expériences rapportées dans nos résultats et les études de littérature antérieures.

Bien que les interactions entre les doses d’électrons soient un facteur important dans de nombreuses expériences TEM, les études in situ et spécifiquement liquide-EM sont particulièrement sensibles à ses effets. La radiolyse des liquides par le faisceau d’électrons entraîne une cascade d’espèces chimiquement réactives qui peuvent interagir avec l’échantillon, compliquant l’analyse. Le débit de dose ou la fluence utilisée au cours d’une expérience EM liquide et la dose cumulative peuvent avoir une influence sur la concentration d’espèces radicalaires générées par radiolyse^{liquide 27,28}. Ainsi, la collecte et l’enregistrement des métadonnées cumulatives des doses et des débits de dose tout au long d’une expérience permettent une corrélation directe entre les images et l’historique des doses d’un échantillon, et constituent un moyen plus précis d’élucider et de contrôler l’impact du faisceau d’électrons dans ces expériences. Bien que cela ne soit pas couvert par ce protocole, un exemple de l’utilité des caractéristiques de gestion de la dose pour la ME liquide est présenté à la figure 6.

Figure 6 : Croissance induite par faisceau de nanoparticules d’or au cours d’une expérience EM liquide in situ. (A) Vue d’ensemble STEM à faible grossissement de la croissance des particules résultante avec une superposition de couleur de la carte des doses cumulées dans toute la région. Les zones rouges dans la superposition indiquent les régions d’exposition à forte dose cumulative et les zones jaunes indiquent les régions où l’exposition est plus faible. La mise en surbrillance d’un pixel individuel avec le curseur ou le dessin d’une boîte sur une zone à l’aide des outils de dessin inclus indique la dose cumulée pour ce pixel ou cette zone. La barre d’échelle est de 2 μm. (B,C) Images STEM à fort grossissement des zones indiquées par les cases orange (b,c) dans A. La zone b, exposée à une dose cumulée plus élevée (10,811 e-/Å 2) contient des particules plus grosses que celles trouvées dans la zone c, qui a été exposée à une dose cumulée plus faible (0,032 e^–/Å ²). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les métadonnées sur le débit de dose enrichi et les doses cumulées simplifient l’analyse des voies de croissance et de dégradation des nanomatériaux dose-dépendantes. La figure 6 montre la réduction induite par faisceau d’une solution d’ions chlorure d’or aurique (HAuCl₃) dans l’eau au cours d’expériences liquide-EM. À partir de la superposition de la carte de dose en couleur de la figure 6A, il est facile de visualiser que la dose cumulative d’électrons influence la taille et la forme résultantes des nanoparticules 29,30,31,32. L’aperçu des STIM à faible grossissement montre les régions exposées à une dose cumulative élevée (rouge) et faible (jaune). Les particules dans la région exposée à des doses plus élevées sont plus grosses que celles dans les régions exposées à des doses cumulatives plus faibles. Étant donné que les métadonnées de dose sont directement intégrées dans chaque image au niveau des pixels, les effets complexes de la dose d’électrons dans les expériences liquide-EM peuvent maintenant être systématiquement analysés d’une manière qui n’était jamais réalisable auparavant.

Dans ce protocole, nous avons démontré que le logiciel MVS fournit une solution complète pour étalonner, surveiller et suivre à la fois la dose d’électrons et la dose totale délivrée à un échantillon pixel par pixel. Cette capacité ouvre la voie à un nouveau paradigme pour l’imagerie d’échantillons sensibles à la dose et la compréhension des interactions avec les faisceaux d’électrons. C’est particulièrement excitant pour les expériences liquide-EM, car cela permettra une interrogation plus efficace sur le rôle que joue la dose d’électrons et améliorera la reproductibilité expérimentale. Nous espérons que ce nouveau cadre permettra la collecte précise de l’information sur le débit de dose et les doses accumulées, facilitera le partage de ces données avec la communauté pour une interprétation plus précise des résultats de la GDT et fera progresser la collaboration scientifique et le partage des données en permettant la production de rapports et l’analyse des principaux rapports et analyses de FAIR.