Усовершенствованный метод изоляции митохондриальных контактных участков

Митохондрии выполняют множество различных функций у эукариот, наиболее известной из которых является производство АТФ путем окислительного фосфорилирования. Другие функции включают производство железо-серных кластеров, синтез липидов, а у высших эукариот — передачу сигналов Ca²⁺ и индукцию апоптоза 1,2,3,4. Эти функции неразрывно связаны с их сложной ультраструктурой.

Митохондриальная ультраструктура была впервые описана с помощью электронной микроскопии⁵. Показано, что митохондрии представляют собой достаточно сложные органеллы, состоящие из двух мембран: митохондриальной наружной мембраны и митохондриальной внутренней мембраны. Таким образом, этими мембранами образуются два водных компартмента: межмембранное пространство и матрикс. Митохондриальная внутренняя мембрана может быть еще более разделена на различные секции. Внутренняя пограничная мембрана находится в непосредственной близости от наружной, а кристы образуют инвагинации. Так называемые кристальные соединения соединяют внутреннюю пограничную мембрану и кристы (рис. 1). Кроме того, электронные микрофотографии осмотически сморщенных митохондрий показывают, что существуют участки, в которых митохондриальные мембраны плотно соединены ^6,7. Эти так называемые контактные участки образованы белковыми комплексами, охватывающими две мембраны (рис. 1). Считается, что эти сайты взаимодействия необходимы для жизнеспособности клеток из-за их важности для регуляции митохондриальной динамики и наследования, а также передачи метаболитов и сигналов между цитозолью и матриксом⁸.

Комплекс MICOS во внутренней мембране митохондрий, вероятно, является наиболее охарактеризованным и наиболее универсальным контактным сайтообразующим комплексом. MICOS был описан у дрожжей в 2011 году и состоит из шести субъединиц 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19^, Mic12 и ^Mic10. Они образуют комплекс примерно в 1,5 МДа, который локализуется в кристальных соединениях 9,10,11. Удаление одной из основных субъединиц, Mic10 или Mic60, приводит к отсутствию этого комплекса ^9,11, что означает, что эти две субъединицы необходимы для стабильности MICOS. Интересно, что MICOS образует не один, а несколько сайтов контакта с различными белками и комплексами митохондриальной внешней мембраны: комплексом TOM 11,12, комплексом TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, комплексом Fzo1-Ugo1⁹, Por1 10^, OM45 10 и Miro ¹⁷. Это убедительно указывает на то, что комплекс MICOS участвует в различных митохондриальных процессах, таких как импорт белка, метаболизм фосфолипидов и генерация митохондриальной ультраструктуры¹⁸. Последняя функция, вероятно, является основной функцией MICOS, поскольку отсутствие комплекса MICOS, индуцированного делецией MIC10 или MIC60, приводит к аномальной ультраструктуре митохондрий, в которой практически полностью отсутствуют регулярные кристы. Вместо этого внутренние мембранные везикулы без соединения с внутренней пограничной мембраной накапливают^{19, 20}. Важно отметить, что MICOS сохраняется по форме и функциям от дрожжей до человека²¹. Связь мутаций в субъединицах MICOS с тяжелыми заболеваниями человека также подчеркивает ее важность для высших эукариот^22,23. Несмотря на то, что MICOS очень универсален, необходимо наличие дополнительных мест контакта (на основании наших неопубликованных наблюдений). Действительно, было идентифицировано несколько других мест контакта, например, механизмы митохондриального слияния Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 или Mdm31-Por1^, который участвует в биосинтезе митохондриально-специфического фосфолипидного кардиолипина ²⁷. Недавно мы усовершенствовали метод, который привел нас к идентификации MICOS для идентификации Cqd1 как части нового контактного сайта, образованного с внешним мембранным комплексом Por1-Om14²⁸. Интересно, что этот контактный сайт также, по-видимому, участвует во многих процессах, таких как гомеостаз митохондриальных мембран, метаболизм фосфолипидов и распределение коэнзима Q^28,29.

Здесь мы использовали вариацию ранее описанного фракционирования митохондрий 9,30,31,32,33. Осмотическая обработка митохондрий приводит к разрушению митохондриальной внешней мембраны и к уменьшению матричного пространства, оставляя две мембраны только в непосредственной близости в местах контакта. Это позволяет генерировать везикулы, состоящие исключительно из митохондриальной внешней мембраны или митохондриальной внутренней мембраны или в местах контакта обеих мембран с помощью мягкого ультразвукового воздействия. Из-за того, что внутренняя мембрана митохондрий обладает гораздо более высоким соотношением белка к липидам, пузырьки внутренней мембраны митохондрий демонстрируют более высокую плотность по сравнению с пузырьками внешней мембраны митохондрий. Разница в плотности может быть использована для разделения мембранных везикул с помощью центрифугирования с градиентом плотности сахарозы. Таким образом, пузырьки внешней мембраны митохондрий накапливаются при низких концентрациях сахарозы, в то время как пузырьки внутренней мембраны митохондрий обогащаются при высоких концентрациях сахарозы. Везикулы, содержащие контактные участки, концентрируются в промежуточных концентрациях сахарозы (рис. 2). Следующий протокол подробно описывает этот усовершенствованный метод, который требует меньше специализированного оборудования, времени и энергии по сравнению с нашим ранее разработанным методом32 и предоставляет полезный инструмент для идентификации возможных белков контактного сайта.