Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

I mitocondri svolgono una varietà di funzioni diverse negli eucarioti, la più nota delle quali è la produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Altre funzioni includono la produzione di cluster ferro-zolfo, la sintesi lipidica e, negli eucarioti superiori, la segnalazione di Ca²⁺ e l’induzione dell’apoptosi 1,2,3,4. Queste funzioni sono indissolubilmente legate alla loro complessa ultrastruttura.

L’ultrastruttura mitocondriale è stata descritta per la prima volta al microscopio elettronico⁵. È stato dimostrato che i mitocondri sono organelli piuttosto complessi costituiti da due membrane: la membrana esterna mitocondriale e la membrana interna mitocondriale. Pertanto, da queste membrane si formano due compartimenti acquosi: lo spazio intermembrana e la matrice. La membrana interna mitocondriale può essere ulteriormente suddivisa in diverse sezioni. La membrana perimetrale interna rimane in prossimità della membrana esterna e le cristae formano invaginazioni. Le cosiddette giunzioni crista collegano la membrana perimetrale interna e le cristae (Figura 1). Inoltre, le micrografie elettroniche dei mitocondri osmoticamente ridotti rivelano che esistono siti in cui le membrane mitocondriali sono strettamente collegate ^6,7. Questi cosiddetti siti di contatto sono formati da complessi proteici che attraversano le due membrane (Figura 1). Si ritiene che questi siti di interazione siano essenziali per la vitalità cellulare a causa della loro importanza per la regolazione della dinamica mitocondriale e dell’ereditarietà, nonché per il trasferimento di metaboliti e segnali tra il citosol e la matrice⁸.

Il complesso MICOS nella membrana interna mitocondriale è probabilmente il complesso di formazione del sito di contatto meglio caratterizzato e più versatile. MICOS è stato descritto nel lievito nel 2011 ed è costituito da sei subunità 9,10,1 ¹: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19^, Mic12 e ^Mic10. Questi formano un complesso di circa 1,5 MDa che si localizza alle giunzioni^crista 9,10,11. La delezione di una delle due subunità principali, Mic10 o Mic60, porta all’assenza di questo complesso ^9,11, il che significa che queste due subunità sono essenziali per la stabilità di MICOS. È interessante notare che MICOS forma non solo uno, ma più siti di contatto con varie proteine e complessi della membrana esterna mitocondriale: il complesso TOM 11,12, il complesso TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, il complesso Fzo1-Ugo1⁹, Por1 10^, OM45 10 e Miro ¹⁷. Ciò indica fortemente che il complesso MICOS è coinvolto in vari processi mitocondriali, come l’importazione di proteine, il metabolismo dei fosfolipidi e la generazione dell’ultrastruttura mitocondriale¹⁸. Quest’ultima funzione è probabilmente la funzione principale di MICOS, in quanto l’assenza del complesso MICOS indotta attraverso la delezione di MIC10 o MIC60 porta ad un’ultrastruttura mitocondriale anomala che manca praticamente completamente di cristae regolari. Invece, le vescicole della membrana interna senza connessione alla membrana di confine interna si accumulano^{19, 20}. È importante sottolineare che MICOS è conservato nella forma e nella funzione dal lievito all’uomo²¹. L’associazione delle mutazioni nelle subunità MICOS con gravi malattie umane sottolinea anche la sua importanza per gli eucarioti superiori^22,23. Sebbene MICOS sia altamente versatile, devono esistere ulteriori siti di contatto (sulla base delle nostre osservazioni non pubblicate). Infatti, sono stati identificati diversi altri siti di contatto, ad esempio i meccanismi di fusione mitocondriale Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 o Mdm31-Por1^, che è coinvolto nella biosintesi del fosfolipide mitocondriale specifico cardiolipina ²⁷. Recentemente, abbiamo migliorato il metodo che ci ha portato all’identificazione di MICOS per identificare Cqd1 come parte di un nuovo sito di contatto formato con il complesso di membrana esterna Por1-Om14²⁸. È interessante notare che questo sito di contatto sembra anche essere coinvolto in molteplici processi come l’omeostasi della membrana mitocondriale, il metabolismo dei fosfolipidi e la distribuzione del coenzima Q^28,29.

Qui, abbiamo usato una variazione del frazionamento dei mitocondri 9,30,31,32,33 precedentemente descritto. Il trattamento osmotico dei mitocondri porta alla rottura della membrana esterna mitocondriale e ad un restringimento dello spazio della matrice, lasciando le due membrane solo in stretta vicinanza nei siti di contatto. Ciò consente la generazione di vescicole costituite esclusivamente da membrana esterna mitocondriale o membrana interna mitocondriale o in siti di contatto contenuti di entrambe le membrane attraverso una lieve sonicazione. A causa della membrana interna mitocondriale che possiede un rapporto proteine-lipidi molto più elevato, le vescicole della membrana interna mitocondriale presentano una densità maggiore rispetto alle vescicole della membrana esterna mitocondriale. La differenza di densità può essere utilizzata per separare le vescicole di membrana attraverso la centrifugazione a gradiente di densità galleggiante del saccarosio. Pertanto, le vescicole della membrana esterna mitocondriale si accumulano a basse concentrazioni di saccarosio, mentre le vescicole della membrana interna mitocondriale si arricchiscono ad alte concentrazioni di saccarosio. Le vescicole contenenti i siti di contatto si concentrano a concentrazioni intermedie di saccarosio (Figura 2). Il seguente protocollo descrive in dettaglio questo metodo migliorato, che richiede attrezzature, tempo ed energia meno specializzate rispetto al nostro^{precedente 32}, e fornisce uno strumento utile per l’identificazione di possibili proteine del sito di contatto.