E. coli'den Rekombinant Protein Dolu Veziküllerin Optimize Edilmiş Üretimi ve Analizi
Summary
Bu protokol, hücre dışı membrana bağlı veziküller içinde paketlenmiş, tipik olarak çözünmeyen veya disülfür bağı içeren proteinler de dahil olmak üzere rekombinant proteinlerin bakteriyel üretimi için ayrıntılı bir yöntem açıklamaktadır. Bu, uygulamalı biyoteknoloji ve tıp da dahil olmak üzere çok yönlü bilimsel araştırma alanlarına uygulanma potansiyeline sahiptir.
Abstract
E. coli’den membrana bağlı veziküllerde çoklu rekombinant proteinleri ihraç eden kısa bir peptit etiketi kullanan bu yenilikçi sistem, bakteriyel rekombinant protein ekspresyonu ile ilişkili bir dizi soruna etkili bir çözüm sunar. Bu rekombinant veziküller, bakterilerden başka türlü zorlu, toksik, çözünmez veya disülfür bağı içeren proteinlerin üretimini kolaylaştıran mikro bir ortamda proteinleri bölümlere ayırır. Vezikül çekirdekli peptid etiketinin yokluğunda tipik bakteri ekspresyonuna kıyasla protein verimi önemli ölçüde artar. Vezikül paketlenmiş proteinlerin salınması, kültür ortamından izolasyonu destekler ve uzun süreli aktif protein depolanmasına izin verir. Bu teknoloji, uygulamalı biyoteknolojiden keşif bilimi ve tıbbına kadar çeşitli uygulamalar için basitleştirilmiş aşağı akış işleme için vezikül paketlenmiş, fonksiyonel proteinlerin veriminin artmasına neden olur. Bu makalede ve ilgili videoda, rekombinant protein dolu vezikül üretimini en üst düzeye çıkarmak için metodolojideki önemli adımları vurgulayan yöntemin ayrıntılı bir protokolü sağlanmıştır.
Introduction
Gram-negatif bakteri E. coli , hem endüstriyel hem de akademik ölçekte rekombinant protein üretimi için çekici bir sistemdir. Sadece yüksek yoğunluklu partiler halinde kültüre uygun maliyetli ve basit olmakla kalmaz, aynı zamanda E. coli1’de fonksiyonel proteinlerin üretimini teşvik etmek için geniş bir reaktifler, suşlar, aletler ve promotörler spektrumu kurulmuştur. Ek olarak, sentetik biyoloji teknikleri şimdi tipik olarak çeviri sonrası modifikasyonların uygulanması ve karmaşık proteinlerin katlanması ile ilgili engellerin üstesinden gelmektedir2. Rekombinant proteinlerin kültür ortamına salgılanmasını hedefleme yeteneği, verimi artırmak ve üretim maliyetlerini azaltmak için caziptir. Kullanıcı tanımlı proteinlerin membran veziküllerine kontrollü bir şekilde paketlenmesi, uygulanan biyoteknoloji ve tıp endüstrilerinde ürün ve teknolojilerin geliştirilmesine yardımcı olur. Şimdiye kadar, E. coli 3’ten rekombinant proteinleri salgılamak için yaygın olarak uygulanabilir yöntemlerin eksikliği vardı.
Eastwood ve ark. yakın zamanda E. coli1’den rekombinant protein içeren veziküllerin üretilmesi ve izole edilmesi için peptid etiketleme tabanlı bir yöntem geliştirmiştir. Bu Vezikül Çekirdeklendirici peptit (VNp), hedef proteinin saflaştırılmasını ve depolanmasını basitleştirmek için tercih edilen rekombinant proteinin hedeflenebileceği hücre dışı bakteriyel membran veziküllerinin üretimine izin verir ve şişe kültürlerinin sallanmasından normalde izin verilenden önemli ölçüde daha yüksek verim sağlar. Şişe kültürünün litresi başına 3 g’a yakın rekombinant protein verimi bildirilmiştir ve VNp etiketinden yoksun eşdeğer proteinlerle elde edilenlerden >100 kat daha yüksek verim elde edilmiştir. Bu rekombinant protein bakımından zenginleştirilmiş veziküller, kültür ortamından hızla saflaştırılabilir ve konsantre edilebilir ve depolama için kararlı bir ortam sağlar. Bu teknoloji, E. coli rekombinant protein üretiminde büyük bir atılımı temsil etmektedir. Veziküller, toksik ve disülfür bağı içeren proteinleri çözünür ve fonksiyonel bir biçimde bölümlere ayırır ve uzun süreli depolama veya doğrudan işleme için vezikül paketli, fonksiyonel proteinlerin basit, verimli ve hızlı saflaştırılmasını destekler1.
Bu teknolojinin mevcut tekniklere göre sunduğu başlıca avantajlar şunlardır: (1) çeşitli boyutlara (1 kDa ila >100 kDa) ve protein türlerine uygulanabilirlik; (2) proteinler arası ve protein içi disülfür bağ oluşumunu kolaylaştırmak; (3) multiprotein komplekslerine uygulanabilir; (4) bir dizi promotör ve standart laboratuvar E. coli suşları ile kullanılabilir; (5) Normalde sadece fermantasyon kültürlerinde görülen sallanan şişelerden protein veriminin üretilmesi; proteinler ihraç edilir ve membrana bağlı veziküllere paketlenir (6) aktif çözünür proteinin depolanması için kararlı bir ortam sağlar; ve (7) çıkış yönündeki işlemeyi ve protein saflaştırmayı basitleştirir. Bu basit ve uygun maliyetli rekombinant protein aracının, biyoteknoloji ve tıp endüstrilerinin yanı sıra keşif bilimi üzerinde de olumlu bir etkisi olması muhtemeldir.
Burada, birkaç yıl içinde geliştirilen ayrıntılı bir protokol, VNp teknolojisi ile bakterilerden rekombinant protein dolu veziküller üretmek için en uygun koşulları açıklamaktadır. Bu sistemin pratikte örnek görüntüleri, üretim, saflaştırma ve konsantrasyonun farklı aşamalarında veziküllerin varlığının görselleştirilmesine izin veren bir floresan proteini eksprese edilerek gösterilmiştir. Son olarak, bakterilerden VNp füzyon içeren veziküllerin üretimini doğrulamak için canlı hücre görüntülemenin nasıl kullanılacağı konusunda rehberlik sağlanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıda tarif edilen rekombinant proteinlerin üretimi için amino-terminal peptid etiketli yöntem, verimli bir şekilde izole edilebilen ve / veya aylarca saklanabilen büyük miktarlarda protein veren basit bir işlemdir.
Bu sistemin optimum kullanımı için gerekli olan protokoldeki temel adımları vurgulamak önemlidir. İlk olarak, VNp etiketi1 , N-terminus’ta bulunmalı, ardından ilgilenilen protein ve uygun etiketler bulunmalıdır. Ampisilin gibi peptidoglikan tabakasını hedef alan antibiyotiklerin kullanılmasından kaçınmak da önemlidir.
Büyüme koşulları açısından, vezikül üretimini en üst düzeye çıkarmak için zengin medya (örneğin, LB veya TB ortamı) ve yüksek bir yüzey alanı: hacim oranı gereklidir. Hücre dışı veziküllerin üretimi için en uygun sıcaklık 37 ° C’dir, ancak ilgilenilen proteinin ekspresyonu için tipik olarak gerekli koşullar da dikkate alınmalıdır. Daha düşük indüksiyon sıcaklıkları için VNp6 kullanılmalıdır. En önemlisi, T7 promotörünün indüksiyonu, hücreler 0.8-1.0’lık bir OD600’e ulaştığında 20 μg / mL (84 μM) IPTG’den daha büyük olmayan bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Sistem kullanılarak eksprese edilen proteinler, 4 saatte veya gece boyunca indüksiyondan sonra maksimum vezikül üretimine ulaşır.
Bu protokolün basitliğine rağmen, optimizasyon gerektirir. VNp varyantı füzyonu, ekspresyon sıcaklıkları ve indüksiyon zaman periyotları, ilgilenilen proteine bağlı olarak farklılık gösterebilir. Ayrıca, ortamdan hücre dışı veziküllerin saflaştırılmasını ve müteakip konsantrasyonunu optimize etmeye ihtiyaç vardır. Geçerli yordam ölçeklenebilir değildir ve zaman alıcı olabilir. Bunlar bu metodolojinin sınırlamalarıdır.
VNp teknolojisinin geleneksel yöntemlere göre birçok avantajı vardır2. Çeşitli proteinlerin veziküler ihracatına izin verir, bugüne kadar başarıyla ifade edilen maksimum boyut, dahili kalan veziküller için 175 kDa ve ihraç edilenler için 85 kDa’dır. Ayrıca, bu teknoloji bir dizi fiziksel özellik ve aktiviteye sahip rekombinant proteinlerin verimini önemli ölçüde artırabilir. İlgili proteini içeren ihraç edilen veziküller, önceden temizlenmiş ortamdan basit filtreleme ile izole edilebilir ve daha sonra steril kültür ortamında veya tamponda, birkaç ay boyunca 4 ° C’de saklanabilir.
Bu sistemin uygulamaları, keşif biliminden uygulamalı biyoteknoloji ve tıbba (örneğin, fonksiyonel terapötiklerin üretimi yoluyla) kadar çeşitlidir3. Üretim kolaylığı, çıkış yönündeki işleme ve yüksek verim, bu alanlarda ve özellikle endüstride çekici niteliklerdir.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, VNp teknolojisini açıklayan makalede sunulan protokol hakkında sorular soran çeşitli Twitter kullanıcılarına teşekkür ediyor. Şekil 1A , flaticon.com’daki simgeler kullanılarak oluşturulmuştur. Bu çalışma Kent Üniversitesi tarafından desteklenmiş ve Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BB / T008/768/1 ve BB / S005544/1) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Ampicillin | Melford | 69-52-3 | |
| Chloramphenicol | Acros Organics (Thermofisher Scientific) | 56-75-7 | |
| E. coli BL21 (DE3) | Lab Stock | N/A | |
| E. coli DH10β | Lab Stock | N/A | |
| Filters for microscope | Chroma | ||
| FM4-64 | Molecular Probes (Invitrogen) | T-3166 | Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM |
| ImageJ | Open Source | Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html | |
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Melford | 367-93-1 | |
| Kanamycin sulphate | Gibco (Thermofisher Scientific) | 11815-024 | |
| LED light source for micrscope | Cairn Research Ltd | ||
| Lysogeny Broth (LB) / LB agar | Lab Stock | N/A | 10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar) |
| Metamorph imaging software | Molecular Devices | ||
| MF-Millipore Membrane filter (0.1 µm, MCE) | Merck | VCWP04700 | |
| Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 µm, PES) | Merck | HPWP04700 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lab Stock | N/A | |
| Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions | Addgene | https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/ | |
| Terrific Broth (TB) | Lab Stock | N/A | 12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4 |
Referências
- Eastwood, T. A., et al. High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli. Cell Reports Methods. 3 (2), 100396 (2023).
- Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria. Microbial Cell Factories. 10, 32 (2011).
- Peng, C., et al. Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139 (2019).
- Lewis, K., Klibanov, A. M. Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials. Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).
- Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).
- Mulvihill, D. P. Live cell imaging in fission yeast. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PloS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Periz, J., et al. A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles. Nature Communications. 10 (1), 4183 (2019).
- Qiu, H., et al. Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends. Science. 352 (6286), 697-701 (2016).
