Producción y análisis optimizados de vesículas recombinantes llenas de proteínas de E. coli

El trabajo bacteriano realizado sigue las regulaciones locales, nacionales e internacionales de contención de bioseguridad acordes con el nivel de peligro de bioseguridad particular de cada cepa. 1. Selección de diferentes VNps Identifique las secuencias VNp.NOTA: Para el presente estudio, se han identificado tres secuencias de VNp1 que resultan en rendimiento máximo y exportación vesicular de las proteínas examinadas hasta la fecha: VNp2, VNp6 y VNp15. Actualmente no está claro por qué ciertas variantes de VNp funcionan de manera más eficiente con algunas proteínas que con otras; por lo tanto, se recomienda que se generen fusiones entre una nueva proteína de interés con cada variante de VNp (es decir, VNp2, 6 o 15).VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLVNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEAAEKTKEGVMVNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVELos plásmidos que permiten la expresión de la proteína de interés con diferentes fusiones amino terminales VNp se han puesto a disposición comercialmente (ver Tabla de materiales). Diseñar una estrategia de clonación para insertar el gen de interés en el extremo 3′ del ADNc que codifica para el VNp en una de estas construcciones, o adaptar un plásmido existente integrando el ADNc VNp sintetizado aguas arriba del primer codón ATG del gen que codifica para la proteína de interés. Utilice los métodos descritos en1. Para proteínas tóxicas, utilice un vector con un promotor de expresión represible o un promotor con un mínimo de ruido de expresión no inducido. Clone la etiqueta de secuencia VNp en el amino-terminal de la proteína de fusión. Asegúrese de que las etiquetas de afinidad, las secuencias de escisión de la proteasa, etc., y la proteína de interés se encuentran en el lado carboxilo de la etiqueta VNp. Se recomienda separar el VNp del péptido aguas abajo con una región enlazadora flexible, como dos o tres repeticiones de una secuencia de polipéptidos -G-G-S-G- (Figura 1).NOTA: Use plásmidos con una selección de antibióticos que no se dirija al peptidoglicano, lo que debilita la superficie celular y reduce el rendimiento de vesículas. Kanamicina y cloranfenicol (ver Tabla de Materiales) fueron los antibióticos preferidos utilizados para este estudio. 2. Cultivo celular bacteriano e inducción de proteínas NOTA: Las cepas bacterianas típicamente utilizadas en este protocolo son Escherichia coli BL21 (DE3) o W3110. Las células de E. coli se cultivan en caldo de lisogenia (LB) (10 g/L triptona; 10 g/L NaCl; 5 g/L de extracto de levadura) o caldo excelente (TB) (12 g/L triptona; 24 g/L de extracto de levadura; 4 mL/L 10% de glicerol; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K2HPO4, sales esterilizadas en autoclave por separado) (ver Tabla de materiales). En la Figura 2 se muestran imágenes de ejemplo que muestran cada paso de la inducción de proteínas y el posterior proceso de aislamiento y purificación. Cultivar 5 ml de LB a partir de transformaciones bacterianas frescas a 37 °C hasta la saturación y utilizarlos para inocular 25 ml de TB en un matraz cónico de 500 ml, todos con la selección adecuada de antibióticos. La relación superficie:volumen es un factor importante para optimizar este sistema. Utilice un matraz de volumen lo más grande posible (p. ej., matraz de 5 L que contenga 1 L de cultivo; para series de optimización, utilice 25 ml de medio en un matraz de 500 ml). Incubar los cultivos de matraces de agitación más grandes en una incubadora a 37 °C con agitación a 200 rpm (≥25 mm de tiro orbital) hasta alcanzar un valor de densidad óptica de 600 nm (OD600) de 0,8-1,0.NOTA: La vesiculación es óptima cuando las células se cultivan a 37 °C. Sin embargo, algunas proteínas recombinantes requieren expresión en temperaturas más bajas. Si este es el caso de la proteína de interés, se debe utilizar la etiqueta VNp6, ya que esto permite la exportación de vesículas de alto rendimiento a temperaturas de hasta 25 °C. Para inducir la expresión de proteínas recombinantes del promotor T7, agregue isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG) a una concentración final de hasta 20 μg/ml (84 μM) (ver Tabla de materiales). La inducción de la expresión de proteínas recombinantes debe ocurrir en la fase logarítmica tardía (es decir, OD600 típico de 0.8-1.0) para la producción de vesículas.NOTA: La duración del período de inducción puede diferir entre las proteínas, algunas alcanzando la producción máxima a las 4 h y otras durante la noche (18 h). Hasta la fecha, se ha obtenido la máxima exportación de vesículas en cultivos nocturnos. 3. Aislamiento de vesículas recombinantes Granular las células por centrifugación a 3.000 x g (4 °C) durante 20 min. Para esterilizar los medios que contienen vesículas para el almacenamiento a largo plazo, pase los medios de cultivo despejados a través de un filtro de polietersulfona (PES) de 0,45 μm estéril y sin detergente (consulte la Tabla de materiales).NOTA: Para probar la exclusión de células viables del filtrado que contiene vesículas, coloque en placa agar LB e incube durante la noche a 37 °C. Para concentrar las vesículas en un volumen más pequeño, pase los medios estériles que contienen vesículas a través de un filtro estéril y sin detergente de ésteres de celulosa mixta (MCE) de 0,1 μm (consulte la Tabla de materiales). Lave suavemente la membrana con 0.5-1 ml de PBS estéril usando un raspador celular o esparcidor de plástico para eliminar cuidadosamente las vesículas de la membrana. Transfiera a un tubo de microfuga nuevo.NOTA: Las vesículas purificadas pueden almacenarse en medios estériles o solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 °C. Existen ejemplos de proteínas recombinantes almacenadas en estas vesículas durante 6 meses, de esta manera, sin pérdida de actividad enzimática. 4. Liberación de proteínas solubles de vesículas aisladas Una vez que las vesículas que contienen proteínas se han aislado en el medio estéril/tampón, someta las membranas lipídicas vesiculares a sonicación utilizando un programa apropiado para el aparato (por ejemplo, ciclos de encendido y apagado de 6x 20 s) y centrifugar a 39,000 x g (4 ° C) durante 20 minutos para eliminar los restos de vesículas.NOTA: El choque osmótico o el tratamiento con detergente se pueden usar como una alternativa para abrir las vesículas, pero se debe considerar el impacto sobre la funcionalidad de las proteínas y / o la aplicación posterior. Si la fusión de VNp permanece citosólica y no se libera en el medio, aísle la proteína utilizando protocolos estándar (p. ej., resuspender los gránulos celulares en 5 ml de un tampón de extracción apropiado (20 mM tris, 500 mM NaCl), sonicar y eliminar los restos celulares por centrifugación). 5. Determinación de la concentración de proteínas Determinar la concentración de proteínas mediante densitometría en gel de análisis de muestras triplicadas1. Ejecute junto con los estándares de carga de albúmina sérica bovina (BSA) en geles de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio teñido con coomassie (SDS-PAGE). Escanee y analice los geles utilizando el software apropiado (por ejemplo, Imagen J; consulte la Tabla de materiales). 6. Visualización de la formación de vesículas y vesículas aisladas por microscopía de fluorescencia NOTA: Si las células contienen marcadores de membrana o fusión VNp marcados con fluorescencia, se pueden usar imágenes de células vivas para seguir la formación de vesículas. Alternativamente, se pueden usar colorantes lipídicos fluorescentes para visualizar vesículas para confirmar la producción y purificación. Montaje celularInducir la expresión de fusión de VNp durante varias horas antes de montarlo en el cubreobjetos. Método de almohadilla de agarosa (Figura 3A-C): pipetear las células en una almohadilla delgada (<1 mm), circular LB-agarosa (2%) que se ha dejado formar y colocar en un portaobjetos de vidrio limpio. Permita que las células se asienten y se equilibren y coloque un cubreobjetos de 50 mm x 25 mm sobre la almohadilla y las celdas. Sostenga el cubreobjetos en su lugar con espaciadores y cinta adhesiva. Método de polietileneimina (PEI) (Figura 3D-F): esparce 20 μL de PEI al 0,05% (endH2O) sobre un cubreobjetos con punta de pipeta y deja actuar durante 3-5 min para que se una al vidrio sin dejar secar. Agregue 50 μL de cultivo celular y déjelo durante 5-10 minutos para asegurarse de que las bacterias se hayan asociado con la superficie recubierta de PEI4. Lave el cubreobjetos con 100 μL de medio antes de colocarlo en el portaobjetos y manténgalo en su lugar con espaciadores y cinta adhesiva. Montaje de vesículasPipeta vesículas purificadas en una almohadilla delgada (<1 mm), circular LB-agarosa (2%) que se ha dejado formar y fijar en un portaobjetos de vidrio limpio. Una vez que el líquido se haya secado, coloque un cubreobjetos de 50 mm x 25 mm sobre la almohadilla y las vesículas. Sostenga el cubreobjetos en su lugar con espaciadores y cinta adhesiva. El colorante lipídico fluorescente FM4-64 es capaz de teñir las membranas5, y por lo tanto se puede utilizar para visualizar vesículas. Agregue FM4-64 (ver Tabla de materiales) a vesículas purificadas a una concentración final de 2 μM (de un stock de 2 mM disuelto en dimetilsulfóxido [DMSO]) e imagen después de una incubación de 10 minutos. Esto es especialmente útil para identificar vesículas que contienen cargas no marcadas con fluorescencia5. Enjuague los cubreobjetos con el mismo medio utilizado para cultivar las células observadas.NOTA: Algunos medios complejos (por ejemplo, TB) pueden exhibir autofluorescencia, lo que puede resultar en un exceso de señal de fondo. Imágenes vesículasNOTA: En la Figura 4 se pueden ver ejemplos de imágenes microscópicas de vesículas recombinantes VNp.Monte el portaobjetos en un microscopio invertido (consulte la Tabla de materiales) utilizando un objetivo de inmersión en aceite y déjelo durante 2-3 minutos para permitir que la muestra se asiente y la temperatura se equilibre.NOTA: Todas las imágenes de células vivas para cada muestra deben completarse dentro de los 30 minutos posteriores al montaje de las células en cubreobjetos para minimizar el impacto de la fototoxicidad y el estrés anaeróbico. Por esta razón, las imágenes de un solo plano son preferibles a las pilas z. Utilice fuentes de luz apropiadas (p. ej., diodo emisor de luz [LED] o bombilla halógena; consulte la Tabla de materiales) y combinaciones de filtros para la(s) proteína(s)/colorante(s) fluorescente(s) que se utiliza6. Use una lente de alto aumento (es decir, 100x o 150x) y alta apertura numérica (es decir, NA ≥1.4) para obtener imágenes de las células microbianas y las vesículas. Determinar la intensidad mínima de luz requerida para visualizar las señales de fluorescencia de las células y/o vesículas. Esto puede requerir algún ajuste de la exposición y la configuración de ganancia para la cámara en uso.NOTA: Los tiempos de exposición típicos de las cámaras CMOS (semiconductores complementarios de óxido metálico) actuales varían entre 50 y 200 ms, dependiendo del sistema de imágenes. Para imágenes de un solo fotograma, utilice un promedio de tres imágenes para reducir el ruido de fondo aleatorio dependiente del hardware. Para imágenes de lapso de tiempo, espere de 3 a 5 minutos entre fotogramas individuales.NOTA: Dependiendo de la configuración del microscopio, es posible que sea necesario ajustar intermitentemente el enfoque durante experimentos de lapso de tiempo más largos.