ייצור וניתוח אופטימליים של בועיות מלאות חלבון רקומביננטי מאי-קולי

עבודת החיידקים המבוצעת עוקבת אחר תקנות הכלת הבטיחות הביולוגית המקומיות, הלאומיות והבינלאומיות המתאימות לרמת הסיכון הבטיחותית הביולוגית הספציפית של כל זן. 1. בחירה של VNps שונים זהה את רצפי VNp.הערה: במחקר הנוכחי זוהו שלושה רצפי VNp1 המביאים לתפוקה מקסימלית ולייצוא שלפוחית של החלבונים שנבדקו עד כה: VNp2, VNp6 ו-VNp15. כיום לא ברור מדוע גרסאות VNp מסוימות מתפקדות ביעילות רבה יותר עם חלבונים מסוימים מאשר עם אחרים; לכן, מומלץ ליצור איחוי בין חלבון חדש מעניין עם כל וריאנט VNp (כלומר, VNp2, 6 או 15).VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLVNp6: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEAAEKTKEGVMVNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVEפלסמידים המאפשרים ביטוי של החלבון המעניין עם איחוי מסוף אמינו VNp שונים הפכו לזמינים באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים). תכנן אסטרטגיית שיבוט כדי להחדיר את הגן המעניין בקצה 3′ של קידוד cDNA עבור VNp באחד מהמבנים האלה, או להתאים פלסמיד קיים על ידי שילוב VNp cDNA מסונתז במעלה הזרם של קודון ATG הראשון של הגן המקודד לחלבון המעניין. השתמש בשיטות כמתואר ב- 1. עבור חלבונים רעילים, השתמש בווקטור עם מקדם ביטוי ניתן לדיכוי או פרומוטור עם רעש ביטוי מינימלי בלתי מושרה. שכפל את תג הרצף VNp במסוף האמינו-טרמינלי של חלבון ההיתוך. ודא כי תגי הזיקה, רצפי מחשוף פרוטאז וכו ‘, ואת החלבון של עניין ממוקמים בצד carboxyl של תג VNp. מומלץ להפריד את VNp מהפפטיד במורד הזרם עם אזור מקשר גמיש, כגון שתיים או שלוש חזרות של רצף פוליפפטיד -G-G-S-G (איור 1).הערה: השתמש פלסמידים עם בחירה אנטיביוטית שאינה מכוונת לפפטידוגליקן, אשר מחליש את פני התא ומפחית את תפוקת השלפוחית. קנמיצין וכלוראמפניקול (ראו טבלת חומרים) היו האנטיביוטיקות המועדפות ששימשו במחקר זה. 2. תרבית תאים חיידקית והשראת חלבונים הערה: זני חיידקים המשמשים בדרך כלל בפרוטוקול זה הם Escherichia coli BL21 (DE3) או W3110. תאי E. coli מגודלים בתרבית במרק ליזוגני (LB) (10 גרם/ליטר טריפטון; 10 גרם/ליטר NaCl; 5 גרם/ליטר תמצית שמרים) או בציר נהדר (שחפת) (12 גרם/ליטר טריפטון; 24 גרם/ליטר תמצית שמרים; 4 מ”ל/ליטר 10% גליצרול; 17 mM KH 2 PO 4; 72 mM K2HPO4, מלחים אוטומטיים בנפרד) מדיה (ראה טבלת חומרים). תמונות לדוגמה המציגות כל שלב בהשראת החלבונים ולאחר מכן תהליך הבידוד והטיהור מוצגות באיור 2. תרבית 5 מ”ל LB מתחילים מטרנספורמציות חיידקים טריים ב 37 ° C לרוויה ולהשתמש בהם כדי לחסן 25 מ”ל של שחפת בבקבוק חרוטי 500 מ”ל, כל זאת עם בחירה אנטיביוטית מתאימה. יחס שטח הפנים:נפח הוא גורם חשוב במיטוב מערכת זו. השתמש בבקבוק נפח גדול ככל האפשר (למשל, בקבוק 5 ליטר המכיל 1 ליטר תרבית; לריצות אופטימיזציה, השתמש ב -25 מ”ל של מדיה בבקבוק של 500 מ”ל). יש לדגור על תרביות הבקבוקים הגדולים יותר באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם טלטול ב-200 סל”ד (≥25 מ”מ זריקת מסלול) עד לקבלת ערך צפיפות אופטית של 600 ננומטר (OD600) של 0.8-1.0.הערה: שלפוחית היא אופטימלית כאשר תאים גדלים ב 37 ° C. עם זאת, חלק מהחלבונים הרקומביננטיים דורשים ביטוי בטמפרטורות נמוכות יותר. אם זה המקרה עבור חלבון של עניין, תג VNp6 חייב לשמש, כמו זה מאפשר ייצוא שלפוחית תפוקה גבוהה בטמפרטורות עד 25 ° C. כדי לגרום לביטוי חלבון רקומביננטי ממקדם T7, הוסף איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לריכוז סופי של עד 20 מיקרוגרם/מ”ל (84 מיקרומטר) (ראה טבלת חומרים). השראת ביטוי חלבון רקומביננטי חייבת להתרחש בשלב הרישום המאוחר (כלומר, OD600 טיפוסי של 0.8-1.0) לייצור שלפוחיות.הערה: משך תקופת האינדוקציה עשוי להשתנות בין חלבונים, כאשר חלקם מגיעים לייצור מקסימלי לאחר 4 שעות ואחרים במהלך הלילה (18 שעות). עד כה, יצוא שלפוחית מקסימלית הושג בתרבויות לילה. 3. בידוד שלפוחית רקומביננטית משחררים את התאים באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורה של 3,000 x גרם (4°C) למשך 20 דקות. כדי לעקר מדיה המכילה שלפוחית לאחסון לטווח ארוך, העבר את מדיית התרבית המפונה דרך מסנן פוליאתרסולפון (PES) סטרילי ונטול חומרי ניקוי 0.45 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים).הערה: כדי לבדוק את ההרחקה של תאים קיימא מן התסנין המכיל שלפוחית, צלחת על אגר LB לדגור לילה ב 37 ° C. כדי לרכז את השלפוחיות לנפח קטן יותר, העבירו את המצע הסטרילי המכיל שלפוחית דרך מסנן סטרילי ונטול חומרי ניקוי של אסטרי תאית מעורבת (MCE) בגודל 0.1 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים). לשטוף בעדינות את הממברנה עם 0.5-1 מ”ל של PBS סטרילי באמצעות מגרד תאים או מפזר פלסטיק כדי להסיר בזהירות שלפוחיות מן הממברנה. מעבירים לצינור מיקרופוגה טרי.הערה: ניתן לאחסן בועיות מטוהרות במדיה סטרילית או במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ב-4°C. ישנן דוגמאות לחלבונים רקומביננטיים המאוחסנים בשלפוחיות אלה במשך 6 חודשים, בדרך זו, ללא אובדן בפעילות אנזימטית. 4. שחרור חלבון מסיס משלפוחיות מבודדות לאחר שבודדו שלפוחיות המכילות חלבון לתוך המדיה/חיץ הסטרילי, יש להעביר את קרומי השומנים השלפוחיתיים לסוניקציה באמצעות לוח זמנים מתאים למכשיר (למשל, 6x 20 שניות במחזורי הפעלה וכיבוי) וצנטריפוגה ב-39,000 x גרם (4°C) למשך 20 דקות כדי להסיר פסולת שלפוחית.הערה: ניתן להשתמש בהלם אוסמוטי או בטיפול בחומרי ניקוי כחלופה לפתיחת השלפוחיות, אך יש לקחת בחשבון את ההשפעה על פונקציונליות החלבון ו / או יישום במורד הזרם. אם היתוך VNp נשאר ציטוסולי ואינו משתחרר למדיה, בודד את החלבון באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים (למשל, השהה מחדש את כדורי התא ב- 5 מ”ל של חיץ מיצוי מתאים (20 mM tris, 500 mM NaCl), סוניקציה והסר את פסולת התא באמצעות צנטריפוגה). 5. קביעת ריכוז החלבונים לקבוע את ריכוז החלבונים על ידי ניתוח צפיפות ג’ל של דגימות טריפליקט1. יש לפעול לצד תקני העמסת אלבומין בסרום בקר (BSA) על ג’ל אלקטרופורזה של ג’ל פוליאקרילאמיד פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) המוכתם בקומסי. סרוק ונתח את הג’לים באמצעות תוכנה מתאימה (לדוגמה, תמונה J; ראה טבלת חומרים). 6. הדמיה של היווצרות שלפוחית ובועיות מבודדות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הערה: אם התאים מכילים סמני איחוי VNp או ממברנה המסומנים באופן פלואורסצנטי, ניתן להשתמש בהדמיית תאים חיים כדי לעקוב אחר היווצרות השלפוחית. לחלופין, ניתן להשתמש בצבעי שומנים פלואורסצנטיים כדי לדמיין שלפוחיות כדי לאשר ייצור וטיהור. הרכבה על תאיםהשראת ביטוי היתוך VNp למשך מספר שעות לפני הרכבה על הכיסוי. שיטת פד אגרוז (איור 3A-C): מפיפטים את התאים על פד LB-agarose עגול דק (<1 מ"מ) שהותר לו להיווצר ולקבע על מגלשת זכוכית נקייה. אפשרו לתאים להתיישב ולהתאזן והניחו מכסה בגודל 50 מ"מ x 25 מ"מ על הפד והתאים. החזיקו את הכיסוי במקומו בעזרת ספייסרים וסרט הדבקה. שיטת פוליאתילניאמין (PEI) (איור 3D-F): מרחו 20 מיקרוליטר של 0.05% PEI (ב-dH2O) על כיסוי עם קצה פיפטה והשאירו למשך 3-5 דקות להיקשר לזכוכית מבלי לאפשר לה להתייבש. הוסיפו 50 מיקרוליטר של תרבית תאים והשאירו למשך 5-10 דקות כדי לוודא שהחיידקים התחברו למשטח המצופה ב-PEI4. שטפו את הכיסוי עם 100 מיקרוליטר של מדיה לפני הנחתו על המגלשה והחזיקו אותו במקומו עם ספייסרים וסרט הדבקה. הרכבה שלפוחיותפיפטה מטהרת שלפוחיות על פד LB-agarose עגול דק (<1 מ"מ) שהותר לו להיווצר ולקבע על מגלשת זכוכית נקייה. לאחר שהנוזל התייבש, הניחו כיסוי בגודל 50 מ"מ x 25 מ"מ על הפד והשלפוחיות. החזיקו את הכיסוי במקומו בעזרת ספייסרים וסרט הדבקה. צבע השומנים הפלואורסצנטי FM4-64 מסוגל להכתים קרומים5, ולכן ניתן להשתמש בו כדי לדמיין שלפוחיות. הוסף FM4-64 (ראה טבלת חומרים) לבועיות מטוהרות בריכוז סופי של 2 מיקרומטר (מציר של 2 מילימטר מומס בדימתיל סולפוקסיד [DMSO]) ותמונה לאחר דגירה של 10 דקות. זה שימושי במיוחד לזיהוי שלפוחיות המכילות מטענים שאינם מסומנים פלואורסצנטית5. שטפו את הכיסויים באותה מדיה המשמשת לתרבית התאים הנצפים.הערה: מדיה מורכבת מסוימת (לדוגמה, שחפת) יכולה להציג אוטופלואורסצנטיות, מה שעלול לגרום לאות רקע עודף. בועיות הדמיההערה: תמונות מיקרוסקופיות לדוגמה של שלפוחיות רקומביננטיות VNp ניתן לראות באיור 4.הרכיבו את המגלשה על מיקרוסקופ הפוך (ראו טבלת חומרים) באמצעות מטרת טבילת שמן והשאירו למשך 2-3 דקות כדי לאפשר לדגימה לשקוע ולטמפרטורה להתאזן.הערה: יש להשלים את כל הדמיית התאים החיים עבור כל דגימה תוך 30 דקות מהרכבת התאים על כיסויים כדי למזער את ההשפעה של פוטוטוקסיות ולחץ אנאירובי. מסיבה זו, תמונות מישור יחיד עדיפות על ערימות z. השתמש במקורות אור מתאימים (לדוגמה, דיודה פולטת אור [LED] או נורת הלוגן; ראה טבלת חומרים) ושילובי מסננים עבור החלבונים/הצבעים הפלואורסצנטיים הנמצאים בשימוש6. השתמש בעדשה בהגדלה גבוהה (כלומר, 100x או 150x) ובצמצם מספרי גבוה (כלומר, NA ≥1.4) להדמיית התאים המיקרוביאליים והשלפוחיות. לקבוע את עוצמת האור המינימלית הנדרשת כדי לדמיין אותות פלואורסצנטיים מתאים ו / או שלפוחיות. פעולה זו עשויה לדרוש התאמה מסוימת של הגדרות החשיפה והרווח עבור המצלמה שבשימוש.הערה: זמני חשיפה אופייניים ממצלמות מוליכים למחצה משלימים של תחמוצת מתכת (CMOS) משתנים בין 50-200 אלפיות השנייה, בהתאם למערכת ההדמיה. לתמונות במסגרת בודדת, השתמשו בממוצע של שלוש תמונות כדי להפחית רעשי רקע אקראיים תלויי חומרה. להדמיה בהילוך מהיר, המתן 3-5 דקות בין מסגרות בודדות.הערה: בהתאם להגדרת המיקרוסקופ, ייתכן שיהיה צורך לכוונן את המיקוד לסירוגין במהלך ניסויים ארוכים יותר בהילוך מהיר.