Полногеномное секвенирование для быстрой характеристики вируса бешенства с использованием технологии нанопор

Исследование было одобрено Координационным комитетом медицинских исследований Национального института медицинских исследований (NIMR/HQ/R.8a/vol. IX/2788), Министерство региональной администрации и местного самоуправления (AB.81/288/01) и Институциональный наблюдательный совет Института здравоохранения Ифакары (IHI/IRB/No:22-2014) в Танзании; Институт тропических и инфекционных болезней Найробийского университета (P947/11/2019) и Кенийский медицинский научно-исследовательский институт (KEMRI-SERU; протокол No 3268) в Кении; и Научно-исследовательский институт тропической медицины (RITM), Департамент здравоохранения (2019-023) на Филиппинах. Секвенирование образцов, происходящих из Нигерии, было проведено на основе архивных диагностических материалов, собранных в рамках национального эпиднадзора. ПРИМЕЧАНИЕ: Разделы 1-4 являются предварительными требованиями. В разделах 5-16 описывается рабочий процесс секвенирования нанопор RABV от образца к последовательности и интерпретации (рис. 1). Для последующих этапов протокола, требующих импульсного центрифугирования, центрифуга при 10-15 000 x g в течение 5-15 с. 1. Настройка вычислительной среды для секвенирования и анализа данных Откройте веб-сайт Oxford Nanopore Technology (ONT)37 и создайте учетную запись для доступа к ресурсам, посвященным нанопорам.Войдите в систему и установите программное обеспечение для определения последовательности ONT и базового вызова38. Откройте GitHub39 и создайте учетную запись.Перейдите в репозитории artic-rabv40 и MADDOG41 и следуйте инструкциям по установке. 2. Разработка или обновление мультиплексной схемы праймера ПРИМЕЧАНИЕ: Существующие схемы RABV доступны в репозитории artic-rabv40. При нацеливании на новую географическую область следует разработать новую схему или изменить существующую, чтобы включить дополнительное разнообразие. Выберите референсный набор генома, представляющий разнообразие в исследуемой области; Как правило, это набор общедоступных последовательностей (например, из NCBI GenBank) или предварительные внутренние данные. Выполните шаг 2.1.1, чтобы использовать RABV-GLUE42, ресурс данных последовательности RABV, для фильтрации и загрузки последовательностей NCBI и связанных метаданных.ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте референсные последовательности с полными геномами (т.е. без пробелов и маскированных оснований). Рекомендуется выбрать до 10 последовательностей в качестве эталонного набора для проектирования праймера. Если имеющиеся данные о последовательностях являются неполными или нерепрезентативными для исследуемой области, обратитесь к рекомендациям43,44,45 в Дополнительном файле 1.Перейдите на страницу NCBI RABV Sequences by Clade из раскрывающегося меню Sequence Data в RABV-GLUE. Нажмите на ссылку Вирус бешенства (RABV), чтобы получить доступ ко всем доступным данным или выбрать конкретную интересующую кладу. Используйте параметр фильтра, чтобы добавить фильтры , соответствующие требуемым критериям (например, страна происхождения, длина последовательности). Скачивание последовательностей и метаданных. Сгенерируйте схему праймера для мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в соответствии с инструкциями, приведенными в Primal Scheme46. Для секвенирования образцов низкого качества рекомендуется использовать схему 400.н. с перекрытием 50.н. Загрузите и сохраните все выходные данные (не редактируйте имена файлов или праймеров).ПРИМЕЧАНИЕ: Схема будет проиндексирована в соответствии с первой последовательностью во входном фасте, которая в дальнейшем будет называться «индексной ссылкой» (рисунок 2). В дополнительном файле 1 приведены параметры оптимизации производительности праймера. 3. Настройка конвейеров биоинформатики RAMPART и ARTIC Обратитесь к Дополнительному файлу 2 , чтобы настроить структуру каталогов для управления входными/выходными файлами для RAMPART и конвейера ARTIC bioinformatics. 4. Биобезопасность и лабораторная организация Работа с потенциально положительными образцами на бешенство в условиях 2 или 3 уровня биобезопасности (BSL). Обеспечить, чтобы сотрудники лабораторий прошли предэкспозиционную вакцинацию против бешенства и мониторинг иммунитета в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)3. Обеспечьте наличие в лаборатории специальных стандартных операционных процедур и оценок рисков в соответствии с национальными или международными рекомендациями. Необходимое лабораторное оборудование: Сведите к минимуму загрязнение, соблюдая физическое разделение между зонами до и после ПЦР. В лабораториях с ограниченным пространством или в полевых условиях используйте переносные перчаточные ящики или импровизированные лабораторные станции, чтобы свести к минимуму загрязнение. В этом протоколе обязательно выделены отдельные области для:Извлечение образцов: Установите шкаф/перчаточный ящик BSL2/3 для работы с биологическим материалом и выполнения инактивации и экстракции РНК. Область шаблона: Установите шкаф/перчаточный ящик BSL1 для добавления матрицы (РНК/кДНК) в предварительно подготовленную мастер-смесь реакции. Зона мастер-микса: Установите специальную чистую зону (шкаф BSL1/перчаточный ящик) для приготовления мастер-смесей реагентов. В этой области не должно быть шаблона. Зона после ПЦР: Выделите отдельную зону для работы над ампликонами и секвенированием библиотечной подготовки.ПРИМЕЧАНИЕ: Все участки должны быть очищены дезинфицирующим средством для поверхностей и стерилизованы ультрафиолетом (УФ) до и после использования. 5. Отбор и диагностика полевых проб ПРИМЕЧАНИЕ: Отбор проб должен производиться обученным и иммунизированным персоналом, носящим средства индивидуальной защиты и соблюдающим стандартные процедуры47,48,49. Собирают пробу через большое затылочное отверстие (т.е. затылочный путь), как подробно описано в Mauti et al.50. Диагностировать бешенство в полевых условиях с помощью диагностических экспресс-тестов и подтверждать его в лаборатории с помощью рекомендуемых процедур47, таких как прямой тест на флуоресцентные антитела (DFA), прямой иммуногистохимический тест (DRIT)51,52 или обратная транскрипция в реальном времени (RT)-PCR 53. Используйте подтвержденные положительные образцы мозга для экстракции РНК или храните в морозильной камере при температуре -20 °C в течение 2-3 месяцев или -80 °C в течение более длительных периодов времени. Сохраняйте РНК для хранения и транспортировки с помощью подходящей среды стабилизации ДНК/РНК. 6. Пробоподготовка и экстракция РНК (3 ч) ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте набор для экстракции вирусной РНК на основе спиновой колонки, подходящий для типа образца. Подготовьте две пробирки с керамическими шариками, заполнив пробирку для ПЦР объемом 2 мл примерно 200 мкл, наполненную керамическими шариками диаметром 1,4 мм, и промаркируйте пробирку. Добавьте рекомендуемый объем лизисного буфера, предусмотренный в наборе для экстракции РНК, в маркированную ПЦР-пробирку. Возьмите примерно 3-миллиметровый кубик из образца мозга с подтвержденной инфекцией бешенства с помощью деревянного аппликатора и поместите в маркированную пробирку с идентификатором образца и 100 мкл воды, не содержащей нуклеаз, в пробирку с маркировкой «отрицательный контроль».ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте гомогенизацию на основе гранул закрытых пробирок, чтобы ограничить воздействие на образец. Если это невозможно, используйте другие подходящие механические разрушители (например, на основе ротора) или ручной микропестик. Тем не менее, они могут быть менее эффективными, чем удары шариками по твердой поверхности для разрушения тканей (образцы тканей могут затвердевать в определенных средах хранения). Повредите ткани мозга вручную с помощью деревянного аппликатора, а затем вихрь с максимальной скоростью, пока не будет достигнута полная гомогенизация тканей. Центрифугируйте лизат в соответствии с инструкциями производителя и используйте пипетку для переноса надосадочной жидкости в новую пробирку для микроцентрифуги с этикеткой. Используйте эту надосадочную жидкость только на последующих этапах. Следуйте инструкциям к спиновой колонке набора для экстракции РНК, чтобы получить очищенную РНК. Включите сюда отрицательный контроль экстракции (NEC) и перейдите к этапу секвенирования. 7. Подготовка кДНК (20 мин) В зоне мастер-смеси подготовьте мастер-смесь для синтеза кДНК первой цепи в соответствии с количеством образцов и контрольных образцов, подлежащих обработке (с превышением объема на 10% для обеспечения адекватного реагента; Таблица 1). На этом этапе должен быть включен элемент управления без шаблона (NTC). Маркируйте пробирки с ПЦР-стрипом объемом 0,2 мл и аликвоту 5 мкл мастер-смеси в пробирки. Отнесите подготовленные пробирки в область шаблона. Добавьте 5 мкл РНК в каждую меченую пробирку, включая NEC. Добавьте 5 мкл безнуклеазной воды (NFW) в NTC. Инкубируйте в амплификаторе в соответствии с условиями, указанными в таблице 1.ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная точка паузы: при необходимости кДНК можно хранить при -20 °C до 1 месяца, но предпочтительнее перейти к ПЦР. 8. Подготовка грунтовочного бассейна (1 ч) ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим только при изготовлении новых запасов из отдельных грунтовок, после чего можно использовать предварительно приготовленные исходные растворы. Подготовьте грунтовочную ванну объемом 100 мкМ в зоне мастер-микса. Ресуспендировать лиофилизированные праймеры в 1x трис-ЭДТА (ТЭ) буфере или NFW в концентрации 100 мкМ каждый. Тщательно взбейте и закрутите вниз.ПРИМЕЧАНИЕ: На следующих этапах отдельные праймеры разделяются на два пула праймеров – нечетный (называемый пулом А) и четный (называемый пулом Б) – чтобы избежать взаимодействия между праймерами, фланкированными ампликонными перекрытиями. Эти пулы праймеров генерируют перекрывающиеся ампликоны размером 400.о., охватывающие геном-мишень. Разложите все нечетные капсюли в штативе для тюбиков. Создайте пул праймеров, добавив 5 мкл из каждого праймера в пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 мл с маркировкой «Название схемы праймера — пул А (100 мкМ)». Повторите процесс для всех праймеров с четными номерами и пометьте их как “Название схемы праймера – Пул B (100 мкМ)”. Разбавьте каждую пулу праймеров в соотношении 1:10 в молекулярной воде для получения 10 мкМ грунтовки.ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте несколько аликвот 10 мкМ разбавлений праймера и заморозьте их в случае деградации или загрязнения. 9. Мультиплексная ПЦР (5 ч) Подготовьте две мастер-смеси ПЦР, по одной для каждого бассейна праймеров в зоне мастер-смеси.Используйте конечную концентрацию 0,015 мкМ на праймер. Рассчитайте необходимый объем пулы праймеров для реакции ПЦР (табл. 2) по следующей формуле:Объем пулы праймеров = количество праймеров x объем реакции x 0,015/концентрация (мкМ) запаса праймера Аликвоту по 10 мкл мастер-смеси пула А и мастер-смеси пула Б в маркированные пробирки для ПЦР-полосок в области шаблона. Для каждого образца добавьте 2,5 мкл кДНК (начиная с шага 3) в каждую из соответствующих меченых реакций пула А и В. Избыток кДНК может храниться при температуре -20 °C. Перемешайте, осторожно взмахивая и пульсируя центрифугой. Инкубируют образцы в условиях, указанных в таблице 2 , на ПЦР-машине.ПРИМЕЧАНИЕ: Программа не включает в себя специальную стадию удлинения из-за большого времени отжига 5 мин (требуется из-за большого количества праймеров) и короткой длины ампликонов (400 п.н.), которая достаточна для растяжения. 10. Очистка и количественное определение ПЦР (3,5 ч) С этого момента выполняйте все работы в зоне после ПЦР. Аликвотные твердофазные обратимые гранулы иммобилизации (SPRI) в микроцентрифужные пробирки из основного флакона. Хранить при температуре 4 °C. Нагрейте шарик SPRI аликвотой до комнатной температуры (RT; ~20 °C) и тщательно перемешайте до тех пор, пока шарики не будут полностью ресуспендированы в растворе. В пробирках объемом 1,5 мл смешайте праймер Pool A и праймер Pool B PCR для каждого образца. При необходимости долейте воды, чтобы довести объем до 25 мкл. Добавьте 25 мкл гранул SPRI в каждый образец (соотношение шарик к образцу 1:1). Перемешайте, пипетируя вверх и вниз или осторожно постукивая по тюбику. Инкубируйте при RT в течение 10 минут, время от времени переворачивая или переворачивая пробирки. Поместите на магнитную решетку до тех пор, пока шарики и раствор полностью не разделятся. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость, стараясь не потревожить гранулу шарика. Дважды промыть 80% этиловым спиртом (подогретым до RT).Добавьте в гранулу 200 мкл этанола. Подождите 30 с, чтобы убедиться, что бусины вымыты должным образом. Осторожно выньте и выбросьте надосадочную жидкость, стараясь не задеть гранулу. Повторите шаги 10.8.1-10.8.2, чтобы промыть гранулы во второй раз. Удалите все следы этанола с помощью наконечника на 10 мкл. Сушить на воздухе до тех пор, пока следы этанола не испарятся (с мелкими шариками это происходит быстро, ~30 с); Когда это произойдет, гранула должна превратиться из блестящей в матовую. Следите за тем, чтобы не пересушить (если гранула трескается, она слишком сухая), так как это повлияет на восстановление ДНК. Повторно суспендируйте шарики в 15 мкл NFW и инкубируйте при RT (вне магнитной стойки) в течение 10 мин. Вернитесь на магнитную стойку и перелейте надосадочную жидкость (очищенный продукт) в свежую пробирку объемом 1,5 мл. Приготовьте разведение 1:10 каждого образца в отдельной пробирке (2 мкл продукта + 18 мкл NFW).ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте очень осторожны на этом этапе, чтобы избежать перекрестного загрязнения. В каждый момент времени должна быть открыта только одна ампликонная трубка. Сначала в пробирки наливают 18 мкл воды (в чистую зону мастер-смеси). Измерьте концентрацию ДНК в каждом разбавленном образце с помощью высокочувствительного и специфического флуориметра, как описано в protocols.io54,55. 11. Нормализация (30 мин) Используйте шаблон нормализации (Дополнительный файл 3) и концентрацию ДНК (нг/мкл) каждого образца для расчета объема разбавленного (или чистого) образца, необходимого для 200 фмоль каждого образца в общем объеме 5 мкл. Пометьте новые пробирки для ПЦР и добавьте рассчитанные объемы NFW и образца для получения нормализованной ДНК. Используйте расчетный объем для неразбавленных (чистых) образцов, если для получения 200 фмоль требуется более 5 мкл разбавленного образца.ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная точка паузы: На этом этапе очищенный продукт ПЦР можно хранить при 4 °C до 1 недели или поместить при -20 °C для более длительного хранения, если это необходимо. 12. Конечная подготовка и штрихкодирование (1,5 часа) ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги предполагают использование специфических реагентов из наборов для штрих-кодирования и лигирования, специфичных для нанопор (см. Таблицу материалов для получения подробной информации). Протокол может быть перенесен между различными версиями химического состава, но пользователи должны позаботиться об использовании совместимых наборов в соответствии с инструкциями производителя. Торцевой ремонт и dA-tailНастройте конечную реакцию подготовки для каждого образца, упомянутого в таблице 3. Приготовьте мастер-микс в соответствии с количеством образцов (плюс 10% избытка). Будьте осторожны при пипетировании, так как реагенты вязкие. Добавьте 5 мкл мастер-смеси в каждую пробирку нормализованной ДНК (5 мкл). Общий объем реакционной смеси должен составлять 10 мкл. Меняйте наконечники каждый раз и открывайте только одну пробирку за раз. Инкубируют в термоциклере в условиях, указанных в таблице 3. Штрих-кодированиеАликвотируйте штрихкоды из набора штрих-кодирования в пробирки для ПЦР по 1,25 мкл/пробирку и записывайте штрих-код, присвоенный каждому образцу. Добавьте 0,75 мкл готового образца к назначенной ему аликвоте штрих-кода. Приготовьте мастер-смесь для лигирования в соответствии с количеством образцов (плюс 10% избытка) (табл. 4). Добавьте 8 мкл мастер-смеси для лигирования к готовому образцу + штрих-кодам, что даст общую реакцию 10 мкл. Инкубируют в амплификаторе в условиях, указанных в таблице 4. Очистка шариков SPRI и количественное определение ДНКРазморозьте буфер коротких фрагментов (SFB) на RT, перемешайте с помощью вихревой, импульсной центрифуги и поместите на лед. Объедините все образцы со штрих-кодом в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Чтобы не сделать объем очистки слишком большим для использования, объединяйте 12–24 образца (10 мкл/образец), до 48 образцов (5 мкл/образец) или до 96 образцов (2,5 мкл/образец) из каждой нативной реакции штрихкодирования. Добавьте 0,4-кратный объем шариков SPRI в пул со штрих-кодом. Осторожно перемешайте (перемешивая или пипетику) и инкубируйте при RT в течение 5 минут. Поместите образцы на магнит до тех пор, пока шарики не гранулируются и надосадочная жидкость не станет полностью прозрачной (~2 мин). Выньте и выбросьте надосадочную жидкость. Следите за тем, чтобы не потревожить бусины. Дважды промойте 250 мкл SFB.Снимите трубку с магнита и полностью ресуспендируйте гранулу в 250 мкл SFB. Инкубируйте в течение 30 с, проведите импульсную центрифугу и верните к магниту. Удалите надосадочную жидкость и выбросьте. Повторите шаг 12.3.5, чтобы выполнить вторую стирку SFB. Импульсная центрифуга и удаление остатков SFB. Добавьте 200 мкл 80% (RT) этанола, чтобы промыть гранулу. Удалите и выбросьте этанол, стараясь не повредить гранулу. Сушить на воздухе в течение 30 с или до тех пор, пока гранула не потеряет свой блеск. Ресуспендировать в 22 мкл NFW при RT в течение 10 мин. Поместите на магнит, оставьте на ~2 минуты, затем осторожно удалите раствор и переложите в чистую пробирку для микроцентрифуг объемом 1,5 мл. Используйте 1 мкл для получения концентрации ДНК, как описано ранее (шаг 10.13).ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительная точка паузы: На этом этапе библиотеку можно хранить при температуре 4 °C до 1 недели или -20 °C для более длительного хранения, но предпочтительнее продолжить лигирование адаптера и секвенирование. 13. Секвенирование (максимум 48 часов) Подготовьте компьютер (см. также разделы 1-4 «Предварительные требования»).Убедитесь, что достаточно места для хранения новых данных (минимум 150 ГБ), данные из старых запусков резервированы/перемещены на сервер перед удалением, а также установлена последняя версия MinKNOW. Извлеките хранящуюся проточную ячейку из холодильника и дайте ей достичь RT. Перевязка адаптера (1 ч)Импульсной центрифугой адаптер перемешать и лигазировать и поместить на лед. Размораживающий элюирующий буфер (EB), SFB и лигирующий буфер на RT. Смешайте с помощью вихревой, импульсной центрифуги и поместите на лед. Приготовьте мастер-смесь для перевязки адаптера (табл. 5), комбинируя реагенты в указанном порядке в пробирке с низким связыванием.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от наличия в лаборатории можно использовать альтернативные реагенты для перевязки (Таблица 5). Список альтернатив см. в Дополнительном файле 3 и Таблице материалов . Используйте вычисления на листе Supplementary File 3 , чтобы получить объем библиотеки ДНК, эквивалентный 200 фмоль. Если вычисляется менее 20 мкл, добавьте NFW, чтобы получить до 20 мкл. Перемешайте легким щелчком и импульсной центрифугой. Инкубируют при RT в течение 20 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инкубации приступайте к подготовке проточной ячейки (раздел 13.5). Очистите с помощью гранул SPRI (не используйте этанол, как в предыдущих чистках).Добавьте к образцам 0,4-кратный объем гранул SPRI (RT). Инкубируйте при RT в течение 10 минут, осторожно периодически помешивайте, чтобы облегчить перемешивание. Поместите на магнит до тех пор, пока шарики и раствор полностью не разделятся (~5 мин). Удалите и выбросьте надосадочную жидкость; Будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулу бисера. Дважды промойте 125 мкл SFB. Полностью ресуспендируйте гранулу 125 мкл SFB, перемешав с помощью пипетки. Оставить инкубироваться на 30 с. Импульсной центрифугой соберите жидкость у основания пробирки и поместите на магнит. Удалите надосадочную жидкость и выбросьте. Повторите шаги 13.4.4-13.4.5, чтобы промыть гранулы во второй раз. Проведите центрифугу в импульсе и удалите излишки SFB. Ресуспендировать в 15 мкл БЭ и инкубировать в течение 10 мин при РТ. Вернитесь к магниту на ~2 мин, а затем осторожно перелейте раствор в чистую пробирку для микроцентрифуги объемом 1,5 мл. Количественно определите 1 мкл элюированной библиотеки, как описано ранее на шаге 10.13ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов переходите непосредственно к секвенированию MinION; однако, при необходимости, окончательная библиотека может храниться в EB при температуре 4 °C до 1 недели. Выполните проточную проверку качества.Подключите устройство виртуализации к ноутбуку и откройте программное обеспечение для виртуализации. Выберите тип проточной ячейки, а затем нажмите кнопку Проверить проточную ячейку и начать тестирование. После завершения отобразится общее количество активных (т.е. жизнеспособных) пор. Новая проточная ячейка должна иметь >800 активных пор; Если это не так, обратитесь к производителю за заменой. Заливка и загрузка проточной ячейки (20 мин)Разморозьте следующие реагенты на RT, а затем поместите буфер секвенирования, промывочный трос, промывочный буфер и загрузочные шарики на лед. Встряхните буфер секвенирования и буфер для промывки, импульсную центрифугу и поместите на лед. Импульсная центрифуга промывочного троса и смешивание с помощью пипетирования; Затем выложите на лед. Приготовьте смесь для заливки проточной ячейки, добавив 30 мкл промывочного троса непосредственно в пробирку промывочного буфера из комплекта для заливки проточной ячейки, и перемешайте пипетированием. Смешивайте загрузочные гранулы пипеткой непосредственно перед использованием, так как они быстро оседают. В свежей пробирке готовят окончательное библиотечное разведение для секвенирования, как указано в таблице 5.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте вычисления на листе Supplementary File 3 , чтобы получить объем библиотеки ДНК, эквивалентный 50 фмоль. Если вычисляется менее 12 мкл, добавьте EB, чтобы получить до 12 мкл. Откиньте крышку устройства последовательности и сдвиньте крышку отверстия для заливки по часовой стрелке так, чтобы отверстие для заливки было видно (Рисунок 3) Осторожно удалите пузырьки воздуха, установив пипетку P1000 на 200 мкл, вставьте наконечник в отверстие для заливки и поворачивайте колесико до тех пор, пока не станет виден небольшой объем, входящий в наконечник пипетки (максимальный оборот до 230 мкл). Загрузите 800 мкл смеси для заливки в проточную ячейку через отверстие для заливки, стараясь избежать образования пузырьков. Оставьте на 5 минут. Осторожно поднимите крышку отверстия для образца и загрузите 200 мкл праймерной смеси в проточную ячейку через заливочное отверстие с помощью пипетки P1000. Перед загрузкой пипетки перемешайте библиотеку вверх и вниз, убедившись, что загрузочные шарики в основной смеси снова взвешены перед загрузкой. Загрузите 75 мкл библиотечной смеси в проточную ячейку через отверстие для образца по каплям. Убедитесь, что каждая капля стекает в порт, прежде чем добавлять следующую. Осторожно установите на место крышку отверстия для отбора проб, убедившись, что пробка входит в отверстие для отбора проб. Закройте отверстие для заливки и установите на место крышку устройства секвенирования. Секвенирование (максимум 48 часов)Подключите устройство секвенирования к ноутбуку и откройте программное обеспечение для секвенирования. Нажмите кнопку Пуск , а затем нажмите кнопку Начать виртуализацию. Нажмите кнопку Создать эксперимент и следуйте рабочему процессу программного обеспечения виртуализации с графическим интерфейсом пользователя (GUI), чтобы настроить параметры выполнения. Введите название эксперимента и идентификатор образца (например, rabv_run1) и выберите Тип ячейки потока в раскрывающемся меню. Перейдите к выбору набора и выберите соответствующий набор для секвенирования лигирования и используемые наборы для штрихкодирования. Перейдите к разделу Параметры выполнения . Сохраняйте значения по умолчанию, если только не требуется, чтобы запуск автоматически останавливался через определенное количество часов (запуски можно остановить вручную в любое время). Перейдите к разделу Basecalling. Выберите, включить или выключить Basecalling в зависимости от вычислительных ресурсов (см. Настройка компьютера). Выберите «Параметры редактирования» в разделе «Штрихкодирование» и убедитесь, что параметр «Штрихкод с обоих концов» включен. Сохраните и перейдите к разделу вывода. Примите значения по умолчанию и перейдите к окончательной проверке, проверьте настройки и запишите сведения в рабочий лист (дополнительный файл 3). Нажмите кнопку Начать.ПРИМЕЧАНИЕ: Если проточная ячейка используется повторно, отрегулируйте пусковое напряжение (в расширенном разделе параметров запуска), как показано на схеме в Дополнительном файле 3. Запишите начальные активные каналы — если он значительно ниже, чем проверка контроля качества (QC), перезапустите программное обеспечение для секвенирования. Если все еще ниже, то перезагрузите компьютер. Запишите начальные каналы в виде нити и одной поры, чтобы получить приблизительную занятость пор. Это число будет колебаться, поэтому дайте приблизительную оценку. Следите за ходом выполнения. 14. Бейсколлинг в прямом эфире и оффлайн ПРИМЕЧАНИЕ: В этих инструкциях предполагается, что ранее существовавшая структура каталогов, предоставленная в репозитории artic-rabv, и что были соблюдены разделы 1 и 3 протокола. В локальной файловой системе создайте новый каталог с именем analysis, в котором будут храниться все результаты анализа. Для дальнейшей организации: создайте подкаталог с именем вашего проекта, а внутри него новый каталог для запуска, используя идентификатор примера, предоставленный MinKNOW, в качестве run_name. Сделайте это одной командой следующим образом:mkdir -pанализ/project_name/run_nameЗатем перейдите к его местоположению:компакт-дискпуть/анализ/project_name/run_name Бейсколлинг в реальном времениПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения вызова нанопор в режиме реального времени ноутбукам требуется графический процессор (GPU), совместимый с NVIDIA CUDA. Убедитесь, что инструкции по настройке базового вызова GPU были выполнены с использованием протокола guppy56.Во время настройки запуска включите бейсколлинг в реальном времени. Используйте RAMPART для мониторинга покрытия последовательности в режиме реального времени, в соответствии с приведенной ниже инструкцией. В терминале компьютера активируйте окружение artic-rabv conda:conda активировать Artic-RABV Создайте новый каталог для вывода rampart внутри каталога run_name и перейдите в него:cd /путь/анализ/project_name/run_namemkdir rampart_outputКомпакт-диск rampart_output Создайте файл штрих-кодов .csv для сопоставления штрихкодов и имен образцов. Он должен иметь одну строку на штрих-код и указывать только те штрих-коды, которые присутствуют в библиотеке, с заголовками «штрих-код» и «образец». Следуйте примеру в каталоге artic-rabv:анализ/example_project/example_run/rampart_output/штрих-коды.csv Запустите RAMPART, указав соответствующую папку протокола и путь к папке fastq_pass в выходных данных MinKNOW для выполнения:rampart –protocol /путь/rampart/scheme_name_V1_protocol – basecalledPath Откройте окно браузера и перейдите к localhost:3000 в поле URL-адреса. Подождите, пока не будет вызвано достаточное количество данных, прежде чем результаты появятся на экране. Автономный вызов базы (выполняется после выполнения)Если живой бейсколлинг не был задан, выходными данными MinKNOW будут необработанные сигнальные данные (файлы fast5). Вы не сможете использовать RAMPART во время бега. Преобразуйте файлы fast5 в basecalled data (файлы fastq) после запуска с помощью guppy (см. настройку на шаге 1.1.1.). Запустите RAMPART post-hoc для basecalled data. Запустите baspy basecaller:guppy_basecaller -c dna_r9.4.1_450bps_fast.cfg -i /путь/к/чтению/fast5_* -s /путь/анализ/project_name/run_name -x auto -r-c – это конфигурационный файл для указания модели basecalling, -i – входной путь, -s – путь сохранения, -x указывает basecalling устройством GPU (исключить при использовании компьютерной версии guppy), а -r указывает на рекурсивный поиск входных файлов.ПРИМЕЧАНИЕ: Конфигурационный файл (.cfg) можно изменить на высокоточный basecaller, заменив _fast на _hac, хотя это займет значительно больше времени. 15. Промывка проточных ячеек Проточные ячейки могут быть промыты и повторно использованы для секвенирования новых библиотек, если поры все еще жизнеспособны. Инструкции по промывке см. в протоколе проточной промывки ячейки ONT57. 16. Анализ и интерпретация Генерация согласованной последовательности с помощью конвейера биоинформатики ARTICСледуйте инструкциям, приведенным в репозитории40 GitHub artic-rabv в папке rabv_protocols, чтобы создать последовательности консенсуса из необработанных файлов fast5 или basecalled fastq.ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дальнейших указаний обратитесь к документу «Арктический трубопровод – основной трубопровод58 ». Необязательно: анализ средней глубины считывания на ампликон.Адаптируйте скрипты, доступные в репозитории artic-rabv, ссылаясь на Дополнительный файл 1. Вкратце, углубленная статистика генерируется с помощью SAMtools59 и покрытия на нуклеотид на графике R. Филогенетический анализ с помощью GLUEВ RABV_GLUE42 выберите вкладку «Анализ > генотипирование и интерпретация » > «Добавить файлы», выбрав fasta-файл консенсусных последовательностей. Нажмите «Отправить» и подождите. После завершения анализа будет доступна кнопка Показать анализ, показывающая присвоение клад и субкладов, покрытие по генам, вариации от референсных последовательностей и ближайшего родственника. Соответствующие контекстуальные последовательности также могут быть идентифицированы в разделе Данные последовательностей > NCBI Sequences by Clade . Выберите идентифицированную кладу или нажмите Вирус бешенства (RABV), чтобы просмотреть все доступные последовательности. Фильтрация по релевантным последовательностям (например, по стране происхождения). Загрузите эти последовательности и соответствующие метаданные для анализа и сравнения. Присвоение родословной с помощью MADDOG41Извлеките репозиторий MADDOG из GitHub, чтобы убедиться, что вы работаете с самой последней версией. Создайте папку назначения в локальном репозитории MADDOG (ранее созданном в разделе Предварительные требования) с именем запуска. Внутри папки добавьте файл fasta, содержащий последовательности консенсуса. Добавьте файл метаданных в папку.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот файл должен быть CSV-файлом с 4 столбцами «ID», «страна», «год» и «назначение», в которых подробно указаны идентификаторы последовательностей, страна выборки и год сбора образцов, а столбец «назначение» должен быть пустым. В интерфейсе командной строки активируйте окружение conda: conda активирует MADDOG. В интерфейсе командной строки перейдите в папку репозитория MADDOG. Первоначально выполните присвоение родословной последовательностям, чтобы проверить наличие любых потенциальных аномалий и определить, будет ли целесообразно выполнить более длинный шаг обозначения родословной. Для этого введите в командной строке следующее: sh assignment.sh. При появлении запроса введите Y, чтобы указать, что вы извлекли репозиторий и работаете с самой последней версией MADDOG. При появлении запроса введите имя папки в папке репозитория MADDOG, содержащей файл fasta. Когда присвоение родословной будет завершено, проверьте выходной файл в папке. Если выходные данные соответствуют ожидаемым и одному и тому же происхождению назначено несколько последовательностей, выполните обозначение происхождения. Если выполняется обозначение происхождения, удалите только что созданный выходной файл назначения. В терминале, внутри папки репозитория MADDOG, выполните команду sh designation.sh. При появлении запроса введите Y, чтобы указать, что вы извлекли репозиторий и работаете с самой последней версией MADDOG. При появлении запроса введите имя папки в папке репозитория MADDOG, содержащей файл fasta и метаданные. В результате выводится информация о происхождении каждой последовательности, филогения новых и соответствующих предыдущих последовательностей (начиная с 16.3.6), иерархическая информация о линиях, а также сведения о потенциально возникающих линиях и областях недостаточной выборки.ПРИМЕЧАНИЕ: Полную информацию о протоколе, использовании и выходных данных можно найти в Campbell et al.60. После завершения первоначального анализа, если вам будет предложено также проверить наличие новых и недостаточных линий, введите Y, если это необходимо. В противном случае введите N. Если вам будет предложено подтвердить вновь найденные родословные, введите Y и следуйте инструкциям в результирующем файле NEXT_STEPS.eml. В противном случае введите N.