ナノポア技術を用いた狂犬病ウイルスの迅速な特性評価のための全ゲノムシーケンシング

本研究は、米国国立医学研究所医学研究調整委員会(NIMR/HQ/R.8a/vol.IX/2788)、タンザニアの地方行政・地方自治省(AB.81/288/01)、およびイファカラ保健研究所治験審査委員会(IHI/IRB/No:22-2014)。ナイロビ大学熱帯感染症研究所(P947/11/2019)およびケニアのケニア医学研究所(KEMRI-SERU;プロトコル番号3268)。フィリピン保健省熱帯医学研究所(RITM)(2019-023)。ナイジェリア産のサンプルのシーケンシングは、国家サーベイランスの一環として収集されたアーカイブされた診断資料に基づいて行われました。 注: セクション 1-4 は前提条件です。セクション 5-16 では、RABV ナノポアシーケンシングのサンプルから配列、解釈までのワークフローについて説明します(図 1)。パルス遠心分離が必要なプロトコルの後続のステップでは、10-15,000 x g で5-15秒間遠心分離します。 1. シーケンシングとデータ解析のための計算環境のセットアップ Oxford Nanopore Technology (ONT) の Web サイト37 を開き、ナノポア固有のリソースにアクセスするためのアカウントを作成します。ログインして、ONTシーケンシングおよびベースコールソフトウェア38をインストールします。 GitHub39 を開き、アカウントを作成します。artic-rabv40 と MADDOG リポジトリ41 に移動し、インストール手順に従います。 2. マルチプレックスプライマースキームの設計または更新 注:既存のRABVスキームは、artic-rabvリポジトリ40で入手可能である。新しい地域をターゲットにする場合は、新しいスキームを設計するか、既存のスキームを変更して多様性を追加する必要があります。 分析範囲の多様性を表すゲノム参照セットを選択します。これは通常、公開されている一連の配列(NCBI GenBankなど)または予備的な社内データです。手順2.1.1に従って、RABV配列データリソースであるRABV-GLUE42を使用して、NCBI配列および関連するメタデータをフィルタリングおよびダウンロードします。注:完全なゲノムを持つ(つまり、ギャップやマスクされた塩基がない)参照配列を選択してください。プライマー設計のリファレンスセットとして最大10個の配列を選択することをお勧めします。利用可能な配列データが不完全であるか、研究地域を代表していない場合は、補足ファイル1のアドバイス43、44、45を参照してください。RABV-GLUEのSequence DataドロップダウンメニューからNCBI RABV Sequences by Cladeページに移動します。狂犬病ウイルス(RABV)リンクをクリックして、利用可能なすべてのデータにアクセスするか、関心のある特定のクレードを選択します。フィルターオプションを使用して、目的の基準(原産国、シーケンス長など)に適合するフィルターを追加します。シーケンスとメタデータをダウンロードします。 マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応(PCR)用のプライマースキームを、PrimalScheme 46の指示に従って生成します。低品質のサンプルのシーケンシングには、オーバーラップが 50 bp の 400 bp スキームが推奨されます。すべての出力をダウンロードして保存します(ファイル名やプライマー名は編集しないでください)。注:このスキームは、入力ファスタの最初のシーケンスにインデックス付けされ、以降は「インデックスリファレンス」と呼ばれます(図2)。プライマーの性能を最適化するためのオプションについては、 補足ファイル1 を参照してください。 3. RAMPARTおよびARTICバイオインフォマティクスパイプラインのセットアップ RAMPARTおよびARTIバイオインフォマティクスパイプラインの入出力ファイルを管理するためのディレクトリ構造を設定するには、 補足ファイル2 を参照してください。 4. バイオセーフティと実験室のセットアップ 狂犬病陽性の可能性のあるサンプルは、バイオセーフティレベル(BSL)2または3の条件で取り扱ってください。 検査室のスタッフが狂犬病の曝露前ワクチン接種を完了し、世界保健機関(WHO)の推奨事項に従って免疫のモニタリングを受けていることを確認します3。 国内または国際的なガイドラインに従った専用の標準操作手順とリスク評価がラボに実施されていることを確認します。 必要なラボのセットアップ:PCR前とPCR後の領域を物理的に分離することで、汚染を最小限に抑えます。スペースが限られているラボや現場のラボ環境では、ポータブルグローブボックスやその場しのぎのラボステーションを使用して、汚染を最小限に抑えます。 このプロトコルでは、次の領域を別々に指定してください。サンプル抽出:BSL2/3キャビネット/グローブボックスを設置して、生体物質を処理し、不活化とRNA抽出を行います。 テンプレート領域:事前に調製した反応マスターミックスにテンプレート(RNA/cDNA)を添加するためのBSL1キャビネット/グローブボックスをセットアップします。 マスターミックスエリア:試薬マスターミックスを調製するために、指定されたクリーンエリア(BSL1キャビネット/グローブボックス)を設置します。この領域にはテンプレートがあってはなりません。 PCR後の領域:アンプリコンおよびシーケンシングライブラリ調製のための作業用に別の領域を設定します。注意: すべての領域は、使用前と使用後に表面除染剤で洗浄し、紫外線(UV)滅菌する必要があります。 5. 現場サンプルの採取と診断 注意: サンプルは、個人用保護具を着用し、参照されている標準手順47、48、49に従って、訓練を受けた予防接種を受けた担当者が収集する必要があります。 Mauti et al.50 に詳述されているように、大孔 (すなわち、後頭経路) を介してサンプルを採取します。 迅速診断検査で野外で狂犬病を診断し、直接蛍光抗体検査(DFA)、直接迅速免疫組織化化学検査(DRIT)51,52、またはリアルタイム逆転写(RT)-PCR53などの推奨手順47を使用して実験室で確認する。 RNA抽出には、陽性が確認された脳サンプルを使用するか、-20°Cで2〜3か月間、または-80°Cで長期間冷凍庫に保管してください。適切なDNA/RNA安定化培地を使用して、保存および輸送のためにRNAを保存します。 6. サンプル調製とRNA抽出(3時間) 注:サンプルタイプに適したスピンカラムベースのウイルス RNA 抽出キットをご使用ください。 2 mL の PCR チューブに 1.4 mm のセラミックビーズを充填した約 200 μL のチューブを充填して、2 本のセラミックビーズチューブを調製し、チューブに標識します。 RNA抽出キットに同梱されている推奨容量の溶解バッファーを標識PCRチューブに加えます。 木製のアプリケーターを使用して狂犬病感染が確認された脳サンプルから約3mmの立方体を取り出し、サンプルIDと100μLのヌクレアーゼフリー水をネガティブコントロールとラベル付けされたチューブに入れます。注:クローズドチューブビーズベースの均質化を使用して、サンプルの曝露を制限します。不可能な場合は、他の適切な機械的破壊剤(ローターベースなど)または手動のマイクロ乳棒を使用してください。ただし、これらは、組織を破壊する硬い表面でのビーズビートよりも効果が低い場合があります(組織サンプルは特定の保存媒体で硬化する可能性があります)。 木製のアプリケータースティックを使用して脳組織を手動で破壊し、組織の完全な均質化が達成されるまで最高速度でボルテックスします。 メーカーの指示に従ってライセートを遠心分離し、ピペットを使用して上清を新しいラベル付き微量遠心チューブに移します。この上清は、以降のステップでのみ使用してください。 RNA抽出キットのスピンカラムの指示に従って、精製されたRNAを入手してください。 ここにネガティブ抽出コントロール(NEC)を含め、シーケンシング段階まで進めます。 7. cDNA調製(20分) マスターミックスエリアでは、処理するサンプル数とコントロール数に応じて、第一鎖cDNA合成用のマスターミックスを調製します(適切な試薬を確保するために、10%の過剰容量で調製します。 表1)。この段階では、テンプレートなしコントロール (NTC) を含める必要があります。 0.2 mL PCR ストリップチューブに標識し、5 μL のマスターミックスをチューブに分注します。 準備したチューブをテンプレートエリアに持っていきます。NECを含む各標識チューブに5 μLのRNAを添加します。5 μLのヌクレアーゼフリー水(NFW)をNTCに加えます。 サーマルサイクラーで、 表1に示す条件に従ってインキュベートします。注:オプションの一時停止ポイント:cDNAは、必要に応じて-20°Cで最大1か月間保存できますが、PCRに進むことをお勧めします。 8. プライマープールストックの準備 (1 時間) 注:このステップは、個々のプライマーから新しいストックを作成する場合にのみ必要であり、その後、事前に調製されたストック溶液を使用できます。 マスターミックスエリアに100 μMストックのプライマープールを調製します。 凍結乾燥したプライマーを1x tris-EDTA(TE)バッファーまたはNFWにそれぞれ100 μMの濃度で再懸濁します。徹底的にボルテックスしてスピンダウンします。注:以下のステップでは、個々のプライマーを奇数番号(プールA)と偶数番号(プールB)の2つのプライマープールに分離し、アンプリコンの重なりに隣接するプライマー間の相互作用を回避します。これらのプライマーのプールは、標的ゲノムにまたがる重複する400 bpアンプリコンを生成します。 奇数番号のプライマーをすべてチューブラックに並べます。「primer scheme name – Pool A (100 μM)」とラベル付けされた 1.5 mL の微量遠心チューブに各プライマーから 5 μL を添加して、プライマープールストックを生成します。 偶数番号のプライマーすべてについてこのプロセスを繰り返し、「プライマースキーム名 – プールB(100μM)」とラベル付けします。 各プライマープールを分子グレードの水で1:10に希釈して、10 μMのプライマーストックを生成します。注:10 μMのプライマー希釈液を複数回分注し、劣化や汚染が発生した場合に凍結します。 9. マルチプレックスPCR(5時間) マスターミックスエリアの各プライマープールに1つずつ、合計2つのPCRマスターミックスを調製します。プライマーあたり最終濃度は 0.015 μM です。PCR反応に必要なプライマープール容量(表2)は、以下の式を用いて計算します。プライマープール容量=プライマー数×反応容量×0.015/プライマー原液濃度(μM) プールAマスターミックスとプールBマスターミックスをそれぞれ10 μLずつ、テンプレート領域の標識PCRストリップチューブに分注します。 各サンプルについて、2.5 μLのcDNA(ステップ3から)を、対応する標識プライマープールAおよびB反応のそれぞれに添加します。過剰なcDNAは-20°Cで保存できます。 静かにフリックして混合し、遠心分離機をパルスします。 表2に記載の条件でサンプルをPCR装置でインキュベートします。注:アニーリング時間が5分と長く(プライマー数が多いために必要)、アンプリコンの長さが短い(400 bp)ため、プログラムには特定の伸長ステップは含まれていません。 10. PCRクリーンアップと定量(3.5時間) この時点から、PCR後の領域ですべての作業を実行します。 固相可逆固定化(SPRI)ビーズをメインボトルから微量遠心チューブに分注します。4°Cで保存してください。 SPRIビーズアリコートを室温(室温;~20°C)に温め、ビーズが溶液に完全に再懸濁されるまで完全にボルテックスします。 1.5 mL チューブに、各サンプルのプライマープール A とプライマープール B の PCR 産物を混ぜ合わせます。必要に応じて、水を加えて容量を25μLにします。 各サンプルに25 μLのSPRIビーズを加えます(ビーズ:サンプル比1:1)。ピペッティングで上下させるか、チューブを軽くたたいて混合します。 室温で10分間インキュベートし、時々チューブを反転またはフリックします。 ビーズと溶液が完全に分離するまで磁気ラックに置きます。ビーズペレットを乱さないように注意しながら、上澄み液を取り除き、廃棄します。 80%エタノール(RTに加温)で2回洗浄します。ペレットにエタノール200μLを加えます。ビーズが適切に洗浄されていることを確認するために30秒待ちます。 ビーズペレットに触れないように、上澄み液を慎重に取り除いて廃棄します。 手順10.8.1〜10.8.2を繰り返して、ペレットをもう一度洗浄します。 10 μLチップを使用して、微量のエタノールをすべて除去します。微量のエタノールが蒸発するまで風乾します(小さなビーズでは、これはすぐに~30秒発生します)。これが発生すると、ペレットは光沢のあるものからつや消しになります。乾燥しすぎないように注意してください(ペレットにひびが入っている場合は、乾燥しすぎています)、DNAの回収に影響を与えます。 ビーズを15 μLのNFWに再懸濁し、室温(オフマグネティックラック)で10分間インキュベートします。 磁気ラックに戻り、上清(洗浄済み製品)を新しい1.5 mLチューブに移します。 各サンプルを別々のチューブ(生成物 2 μL + NFW 18 μL)で 1:10 希釈液を調製します。注意: この段階では、クロスコンタミネーションを避けるために十分に注意してください。一度に開くアンプリコンチューブは1本だけにしてください。最初に18 μLの水をチューブに分注します(クリーンなマスターミックスエリアで)。 protocols.io54,55に記載されているように、高感度で特異的な蛍光光度計を使用して、希釈した各サンプルのDNA濃度を測定します。 11.ノーマライゼーション(30分) ノーマライゼーションテンプレート(補足ファイル3)と各サンプルのDNA濃度(ng/μL)を使用して、各サンプルの総容量5 μLで各サンプルの200 fmolに必要な希釈(またはきちんとした)サンプルの容量を計算します。 新しいPCRチューブを標識し、計算されたNFWとサンプルを追加して、正規化されたDNAを取得します。 200 fmolを得るために5 μLを超える希釈サンプルが必要な場合は、未希釈(ニート)サンプルに計算された容量を使用します。注:オプションの一時停止ポイント:この時点で、クリーンアップされたPCR産物は、必要に応じて4°Cで最大1週間保存するか、-20°Cで長期保存することができます。 12. エンドプレップとバーコード化 (1.5 h) 注:次のステップでは、ナノポア固有のバーコードおよびライゲーションシーケンシングキットの特定の試薬を使用することを前提としています(詳細については 、材料表 を参照)。このプロトコルは、異なる化学バージョン間で転送可能ですが、ユーザーはメーカーの指示に従って、互換性のあるキットを使用するように注意する必要があります。 末端補修とdAテーリング表 3 に記載されている各サンプルについて、エンドプレップ反応をセットアップします。サンプル数(プラス10%超過分)に応じてマスターミックスを調製します。試薬は粘性があるため、ピペッティングの際には注意してください。 標準化されたDNAの各チューブ(5 μL)に5 μLのマスターミックスを加えます。総反応ミックスは10 μLにしてください。 チップは毎回交換し、一度に1本のチューブだけを開いてください。 サーマルサイクラーで表 3に示す条件でインキュベートします。 バーコードバーコードキットのバーコードを1.25 μL/チューブでPCRストリップチューブに分注し、各サンプルに割り当てられたバーコードを記録します。 0.75 μL のエンドプレップしたサンプルを、割り当てられたバーコードアリコートに加えます。 サンプル数(プラス10%過剰)に応じてライゲーションマスターミックスを調製します(表4)。 8 μLのライゲーションマスターミックスをエンドプレップしたサンプル+バーコードに加え、合計10 μLの反応が得られます。 サーマルサイクラーで、 表4に示す条件でインキュベートします。 SPRIビーズのクリーンアップとDNA定量ショートフラグメントバッファー(SFB)を室温で融解し、ボルテックスで混合し、パルス遠心分離機で分離し、氷上に置きます。 すべてのバーコード付きサンプルを1.5 mLのローバインド微量遠心チューブにプールします。クリーンアップ量が大きくなりすぎて使用できないように、各ネイティブバーコード反応から12〜24サンプル(10 μL /サンプル)、最大48サンプル(5 μL /サンプル)、または最大96サンプル(2.5 μL /サンプル)をプールします。 0.4倍の量のSPRIビーズをバーコードプールに追加します。穏やかに混合し(フリックまたはピペッティング)、室温で5分間インキュベートします。 ビーズがペレット化し、上清が完全に透明になるまで(~2分)サンプルを磁石の上に置きます。上澄み液を取り出して廃棄します。ビーズを乱さないように注意してください。 250 μL の SFB で 2 回洗浄します。チューブを磁石から取り外し、ペレットを250μLのSFBに完全に再懸濁します。30秒間インキュベートし、パルス遠心分離機にかけ、磁石に戻します。 上澄み液を取り除き、廃棄する。 手順 12.3.5 を繰り返して、2 回目の SFB 洗浄を実行します。 パルス遠心分離機にかけ、残留SFBを除去します。 200μLの80%(RT)エタノールを加えてペレットを浸します。ビーズペレットを乱さないように注意しながら、エタノールを取り出して廃棄します。30秒間、またはペレットが輝きを失うまで風乾します。 22 μL の NFW を室温で 10 分間再懸濁します。 磁石の上に置き、~2分間沈静化させてから、溶液を慎重に取り除き、清潔な1.5 mL微量遠心チューブに移します。 前述したように、1 μLを使用してDNA濃度を得ます(ステップ10.13)。注:オプションの一時停止ポイント:この時点で、ライブラリは4°Cで最大1週間保存でき、長期保存の場合は-20°Cで保存できますが、アダプターのライゲーションとシーケンシングを続行することをお勧めします。 13.シーケンシング(最大48時間) コンピューターを準備します (前提条件のセクション 1 から 4 も参照してください)。新しいデータを保存するのに十分なスペース (最小 150 GB) があること、古い実行のデータが削除する前にサーバーにバックアップ/移動されていること、および最新バージョンの MinKNOW がインストールされていることを確認します。 保管したフローセルを冷蔵庫から取り出し、RTに到達させます。 アダプターライゲーション (1 h)アダプターミックスとリガーゼをパルス遠心分離し、氷上に置きます。 溶出バッファー(EB)、SFB、ライゲーションバッファーを室温で融解し、ボルテックスで混合し、パルス遠心分離機で分離し、氷上に置いた。 アダプターライゲーションマスターミックス(表5)を調製し、低結合チューブ内で指定された順序で試薬を混合します。注:アダプターライゲーションマスターミックス試薬の代替品(表5)は、ラボでの在庫状況に応じて使用できます。代替案のリストについては、 補足ファイル3 および 材料表 を参照してください。 Supplementary File 3 ワークシートの計算を使用して、200 fmolに相当するDNAライブラリの体積を取得します。計算量が20 μL未満の場合は、NFWを添加して最大20 μLにします。 穏やかにフリックして混合し、遠心分離機をパルスします。室温で20分間インキュベートします。注:インキュベーション中に、フローセルの準備を開始します(セクション13.5)。 SPRIビーズを使用してクリーンアップします(以前のクリーンアップのようにエタノールは使用しないでください)。0.4倍の量のSPRIビーズ(RT)をサンプルに添加します。室温で10分間インキュベートし、間欠的に静かにフリックして混合を促進します。 ビーズと溶液が完全に分離するまで(~5分)磁石の上に置きます。上澄み液を取り除き、廃棄します。ビーズペレットを乱さないように注意してください。 125 μL の SFB で 2 回洗浄します。 ピペットで混合することにより、125 μLのSFBでペレットを完全に再懸濁します。30秒間インキュベートします。 パルス遠心分離機でチューブの底部に液体を集め、磁石の上に置きます。上澄み液を取り除き、廃棄する。 手順13.4.4〜13.4.5を繰り返して、ペレットをもう一度洗浄します。 パルス遠心分離機で余分なSFBを除去します。 15 μL の EB に再懸濁し、室温で 10 分間インキュベートします。 磁石に~2分間戻してから、溶液を清潔な1.5 mL微量遠心チューブに慎重に移します。 溶出したライブラリー 1 μL を、ステップ 10.13 で前述したように定量します注:最良の結果を得るには、MinIONシーケンシングに直接進んでください。ただし、最終的なライブラリは、必要に応じてEBで4°Cで最大1週間保存できます。 フローセルの品質チェックを実行します。シーケンシングデバイスをラップトップに接続し、シーケンシングソフトウェアを開きます。 フロー セル タイプを選択し、[フロー セルの確認とテストの開始] をクリックします。 完了すると、アクティブな(つまり、生存可能な)細孔の総数が表示されます。新しいフローセルには、>800のアクティブな細孔が必要です。そうでない場合は、製造元に交換を依頼してください。 フローセルのプライミングとローディング(20分)以下の試薬を室温で融解し、シーケンシングバッファー、フラッシュテザー、フラッシュバッファー、およびローディングビーズを氷上に置きます。 シーケンシングバッファーとフラッシュバッファーをボルテックスし、パルス遠心分離機にかけ、氷上に置いてください。 フラッシュテザーをパルス遠心分離し、ピペッティングで混合します。次に、氷の上に置きます。 フローセルプライミングキットからフラッシュバッファーのチューブに30 μLのフラッシュテザーを直接添加して、フローセルプライミングミックスを調製し、ピペッティングで混合します。 ローディングビーズはすぐに沈降するため、使用直前にピペッティングで混合してください。 新鮮なチューブで、 表 5 に記載のとおり、シーケンシング用の最終ライブラリー希釈液を調製します。注: Supplementary File 3 ワークシートの計算を使用して、50 fmolに相当するDNAライブラリの容量を取得します。計算値が 12 μL 未満の場合は、EB を追加して最大 12 μL にします。 シーケンシングデバイスの蓋を裏返し、プライミングポートカバーを時計回りにスライドさせて、プライミングポートが見えるようにします(図3) P1000ピペットを200 μLに設定して気泡を慎重に除去し、チップをプライミングポートに挿入し、ピペットチップに少量の液体が入るのがわかるまでホイールを回します(最大回転は230 μL)。 800 μLのフローセルプライミングミックスをプライミングポート から フローセルにロードし、気泡が発生しないように注意します。 5分間放置します。 サンプルポートカバーを静かに持ち上げ、P1000ピペットを使用してプライミングポート から 200 μLのプライミングミックスをフローセルにロードします。 ロード前にライブラリミックスを上下にピペットで固定し、マスターミックスのローディングビーズがロード前に再懸濁されていることを確認します。 75 μL のライブラリーミックスを、サンプルポート から フローセルに滴下します。次のドリップを追加する前に、各ドリップがポートに流れ込むことを確認してください。 サンプルポートカバーを静かに元に戻し、栓がサンプルポートに入ることを確認します。 プライミングポートを閉じ、シーケンシングデバイスの蓋を取り付けます。 シーケンシングラン(最大48時間)シーケンシングデバイスをラップトップに接続し、シーケンシングソフトウェアを開きます。 [開始] をクリックし、[シーケンスの開始] をクリックします。 [New Experiment] をクリックし、シーケンシングソフトウェアのグラフィカルユーザーインターフェース (GUI) ワークフローに従って、実行のパラメーターを設定します。 実験名とサンプル ID (例: rabv_run1) を入力し、ドロップダウン メニューから [ フロー セル タイプ ] を選択します。 キットの選択に進み、使用するライゲーションシーケンシングキットとネイティブバーコードキットを選択します。 「 実行 オプション」に進みます。特定の時間数が経過すると実行が自動的に停止する場合を除き、既定値のままにします (実行はいつでも手動で停止できます)。 ベースコールに進みます。コンピューティングリソースに応じて、ベースコールのオン/オフを選択します(コンピュータの設定を参照)。バーコードの下の「オプションを編集」を選択し、「両端のバーコード」がオンになっていることを確認します。保存して出力セクションに進みます。 デフォルトを受け入れて最終レビューを続行し、設定を確認して、ワークシート(補足ファイル3)に詳細を記録します。「 開始」をクリックします。注意: フローセルを再利用する場合は、 補足ファイル3のスキームに示されているように、始動電圧を(実行オプションの[詳細]セクションで)調整します。 最初のアクティブチャンネルを記録し、これが品質管理(QC)チェックよりも大幅に低い場合は、シーケンシングソフトウェアを再起動します。それでも低い場合は、コンピュータを再起動します。 初期チャネルをストランドと単一細孔で記録し、おおよその細孔占有率を求めます。この数値は変動しますので、概算値を与えてください。 実行の進行状況を監視します。 14.ライブとオフラインのベースコール 注: これらの手順は、artic-rabv リポジトリで提供されている既存のディレクトリ構造と、プロトコルの前提条件セクション 1 と 3 に従っていることを前提としています。 ローカルファイルシステム上に、analysisという新しいディレクトリを作成し、そこにすべての分析出力を格納します。さらに整理するには、プロジェクトの名前でサブディレクトリを作成し、その中にMinKNOWに提供されたサンプルIDをrun_nameとして使用して、実行用の新しいディレクトリを作成します。これは、次のように 1 つのコマンドで行います。mkdir -p分析/project_name/run_name次に、その場所に移動します。cdパス/分析/project_name/run_name ライブベースコーリング注:ナノポアベースコールをリアルタイムで実行するには、ラップトップにNVIDIA CUDA互換のグラフィックスプロセッシングユニット(GPU)が必要です。GPU ベースコール設定の指示が、グッピー プロトコル56 を使用して実行されたことを確認します。実行のセットアップ中に、ライブ ベースコールをオンにします。 RAMPARTを使用して、以下の手順に従って、シーケンシングカバレッジをリアルタイムで監視します。 コンピューターのターミナルで、artic-rabv conda 環境をアクティブにします。conda activate artic-rabv run_nameディレクトリ内にランパート出力用の新しいディレクトリを作成し、そのディレクトリに移動します。cd /path/analysis/project_name/run_namemkdir rampart_outputCD rampart_output バーコードとサンプル名をペアにするバーコード.csvファイルを作成します。バーコードごとに 1 行を指定し、ライブラリに存在するバーコードのみを指定し、見出しが “barcode” と “sample” である必要があります。artic-rabvディレクトリの例に従います。分析/example_project/example_run/rampart_output/バーコード.csv 実行のMinKNOW出力で、関連するプロトコルフォルダとfastq_passフォルダへのパスを指定して、RAMPARTを起動します。rampart –protocol /path/rampart/scheme_name_V1_protocol – basecalledPath ブラウザー ウィンドウを開き、[URL] ボックスで localhost:3000 に移動します。十分なデータがベースコールされるのを待ってから、結果が画面に表示されます。 オフライン ベースコール (実行後に実行)ライブベースコールが設定されていない場合、MinKNOWからの出力は生の信号データ(fast5ファイル)になります。実行中はRAMPARTを使用できません。実行後に guppy を使用して fast5 ファイルをベースコール データ (fastq ファイル) に変換します (前提条件の手順 1.1.1 のセットアップを参照)。ベースコールされたデータに対して RAMPART を事後的に実行します。 グッピーのベースコーラーを実行します。guppy_basecaller -c dna_r9.4.1_450bps_fast.cfg -i /path/to/reads/fast5_* -s /path/analysis/project_name/run_name -x auto -r-c はベースコールモデルを指定する設定ファイル、 -i は入力パス、 -s は保存パス、 -x は GPU デバイスによるベースコール (コンピュータ版 guppy を使用している場合は除外)、 -r は入力ファイルを再帰的に検索することを指定します。注: 設定ファイル (.cfg) は、_fast を _hac に置き換えることで、高精度のベースコーラーに変更できますが、これにはかなりの時間がかかります。 15. フローセルの洗浄 フローセルを洗浄して再利用し、細孔がまだ生存可能な場合は、新しいライブラリの配列決定に再利用できます。ONTフローセル洗浄プロトコル57の洗浄手順を参照してください。 16. 分析と解釈 ARTIバイオインフォマティクスパイプラインによるコンセンサス配列生成rabv_protocols フォルダー内の artic-rabv GitHub リポジトリ40 に詳述されている手順に従って、生の fast5 または basecalled fastq ファイルからコンセンサス配列を生成します。注: 詳細については、「Artic パイプライン – コア パイプライン58 」を参照してください。 オプション: アンプリコンごとの平均読み取り深度を分析します。artic-rabv リポジトリから入手できるスクリプトを、 補足ファイル 1 を参照して適応させます。簡単に言うと、SAMtools59 と R でプロットされたヌクレオチドごとのカバレッジを使用して、詳細な統計が生成されます。 GLUEを用いた系統解析RABV_GLUE42 から、ファイルの追加> Analysis > Genotyping and Interpretation タブを選択し、コンセンサス配列の fasta ファイルを選択します。 [ 送信 して待機] をクリックします。解析が完了すると、[ Show Analysis ]ボタンがクリック可能になり、クレードとサブクレードの割り当て、遺伝子ごとのカバレッジ、参照配列からの変異、および最も近い近縁種が表示されます。 関連するコンテキスト配列は、 クレード別のNCBI配列>配列 データ配列のセクションでも特定できます。 同定されたクレードを選択するか、[ 狂犬病ウイルス(RABV)] をクリックして、利用可能なすべての配列を表示します。 関連する配列(原産国など)をフィルタリングします。 これらの配列と対応するメタデータをダウンロードして、解析と比較を行います。 MADDOG41 を使用した系統割り当てGitHubからMADDOGリポジトリをプルして、最新バージョンで作業していることを確認します。 ローカルの MADDOG リポジトリー (前提条件 セクションで作成済み) 内に、実行名と呼ばれる割り当てフォルダーを作成します。 フォルダ内に、コンセンサスシーケンスを含むfastaファイルを追加します。 フォルダーにメタデータ ファイルを追加します。注:このファイルは、「ID」、「国」、「年」、「割り当て」という4つの列を持つcsvでなければならず、シーケンスID、サンプリングの国、サンプル収集の年を詳述し、「割り当て」列は空白にする必要があります。 コマンドライン・インタフェースで、conda環境をアクティブ化します:conda activate MADDOG。 コマンドラインインターフェイスで、MADDOGリポジトリフォルダに移動します。 最初に、シーケンスに系統の割り当てを行って、潜在的な異常をチェックし、より長い系統指定ステップを実行することが適切かどうかを特定します。このためには、コマンドラインに sh assignment.sh と入力します。 プロンプトが表示されたら、Yを入力して、リポジトリをプルし、最新バージョンのMADDOGで作業していることを示します。 プロンプトが表示されたら、fasta ファイルを含む MADDOG リポジトリフォルダー内のフォルダーの名前を入力します。 系列の割り当てが完了したら、フォルダー内の出力ファイルを確認します。出力が期待どおりで、同じ系列に複数のシーケンスが割り当てられている場合は、系列指定を実行します。 リネージュ指定を実行している場合は、作成した割り当て出力ファイルを削除します。 ターミナルのMADDOGリポジトリフォルダ内で、 コマンドsh designation.sh を実行します。 プロンプトが表示されたら、Yを入力して、リポジトリをプルし、最新バージョンのMADDOGで作業していることを示します。 プロンプトが表示されたら、fasta ファイルとメタデータを含む MADDOG リポジトリフォルダー内のフォルダー名を入力します。これにより、各配列に関する系統情報、新しい配列と関連する以前の配列の系統発生(16.3.6以降)、系統に関する階層情報、および潜在的に出現する系統とアンダーサンプリング領域の詳細が出力されます。注: プロトコル、使用法、および出力の詳細については、Campbell et al.60 を参照してください。 初期分析が完了し、新規およびアンダーサンプリングされた系統もテストするように求められたら、必要に応じて「Y」を入力します。それ以外の場合は、「N」と入力します。 新しく見つかった系列を確認するように求められたら、「Y」と入力し、結果の NEXT_STEPS.eml ファイルの指示に従います。それ以外の場合は、「N」と入力します。