Sequencing van het hele genoom voor snelle karakterisering van het rabiësvirus met behulp van nanoporietechnologie

De studie werd goedgekeurd door de Medical Research Coordinating Committee van het National Institute for Medical Research (NIMR/HQ/R.8a/vol. IX/2788), het ministerie van Regionaal Bestuur en Lokaal Bestuur (AB.81/288/01) en de Ifakara Health Institute Institutional Review Board (IHI/IRB/No:22-2014) in Tanzania; het Instituut voor Tropische en Infectieziekten van de Universiteit van Nairobi (P947/11/2019) en het Kenya Medical Research Institute (KEMRI-SERU; protocol nr. 3268) in Kenia; en het Research Institute for Tropical Medicine (RITM), Department of Health (2019-023) in de Filippijnen. Sequentiebepaling van monsters afkomstig uit Nigeria werd uitgevoerd op gearchiveerd diagnostisch materiaal dat was verzameld als onderdeel van nationale surveillance. OPMERKING: Sectie 1-4 zijn vereisten. In sectie 5-16 wordt de workflow van steekproef naar sequentie naar interpretatie voor RABV-sequencing van nanoporiën beschreven (Figuur 1). Voor volgende stappen in het protocol die pulscentrifugatie vereisen, centrifugeert u op 10-15.000 x g gedurende 5-15 s. 1. Opzetten van een computeromgeving voor sequencing en data-analyse Open de website van Oxford Nanopore Technology (ONT)37 en maak een account aan om toegang te krijgen tot nanopore-specifieke bronnen.Log in en installeer de ONT sequencing en basecalling software38. Open GitHub39 en maak een account aan.Ga naar de artic-rabv40 en MADDOG repositories41 en volg de installatie-instructies. 2. Ontwerp of update het multiplex primerschema OPMERKING: Bestaande RABV-schema’s zijn beschikbaar in de artic-rabv-repository40. Wanneer men zich op een nieuw geografisch gebied richt, moet een nieuwe regeling worden ontworpen of een bestaande regeling worden gewijzigd om extra diversiteit op te nemen. Kies een genoomreferentieset om de diversiteit in het studiegebied weer te geven; dit is meestal een reeks openbaar beschikbare sequenties (bijv. van NCBI GenBank) of voorlopige interne gegevens. Volg stap 2.1.1 om RABV-GLUE42, een RABV-sequentiegegevensbron, te gebruiken om NCBI-sequenties en bijbehorende metagegevens te filteren en te downloaden.OPMERKING: Kies referentiesequenties met volledige genomen (d.w.z. zonder gaten en gemaskeerde basen). Het wordt aanbevolen om maximaal 10 sequenties te kiezen als referentieset voor het ontwerp van de primer. Als de beschikbare sequentiegegevens onvolledig of niet representatief zijn voor het onderzoeksgebied, raadpleeg dan het advies43,44,45 in aanvullend dossier 1.Navigeer naar de pagina NCBI RABV Sequenties per Clade in het vervolgkeuzemenu Sequentiegegevens in RABV-GLUE. Klik op de link Rabiësvirus (RABV) om toegang te krijgen tot alle beschikbare gegevens of selecteer een bepaalde clade die u interesseert. Gebruik de filteroptie om filters toe te voegen die voldoen aan de gewenste criteria (bijv. land van herkomst, sequentieduur). Download sequenties en metadata. Genereer een primerschema voor multiplex polymerasekettingreactie (PCR) volgens de instructies van Primal Scheme46. Een schema van 400 bp met een overlapping van 50 bp wordt aanbevolen om monsters van lage kwaliteit te sequencen. Download en bewaar alle uitvoer (bewerk de bestands- of primernamen niet).OPMERKING: Het schema wordt geïndexeerd naar de eerste sequentie in de invoerfasta, hierna aangeduid als de ‘indexreferentie’ (Figuur 2). Zie Aanvullend bestand 1 voor opties om de prestaties van de primer te optimaliseren. 3. Opzetten van RAMPART en ARTIC bio-informatica pipelines Raadpleeg Aanvullend bestand 2 om een mappenstructuur in te stellen voor het beheren van de invoer-/uitvoerbestanden voor RAMPART en de ARTIC-bioinformaticapijplijn. 4. Bioveiligheid en laboratoriuminrichting Behandel potentieel rabiës-positieve monsters in bioveiligheidsniveau (BSL) 2 of 3 omstandigheden. Zorg ervoor dat het laboratoriumpersoneel de vaccinatie tegen hondsdolheid vóór blootstelling heeft voltooid en de immuniteit wordt gecontroleerd volgens de aanbevelingen van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO)3. Zorg ervoor dat er specifieke standaard operationele procedures en risicobeoordelingen zijn, volgens nationale of internationale richtlijnen, voor het laboratorium. Vereiste laboratoriumopstelling: Minimaliseer besmetting door fysieke scheiding te handhaven tussen pre- en post-PCR-gebieden. Gebruik in laboratoria met beperkte ruimte of laboratoriumomgevingen in het veld draagbare handschoenkastjes of geïmproviseerde laboratoriumstations om besmetting tot een minimum te beperken. Zorg ervoor dat in dit protocol afzonderlijke gebieden worden aangewezen voor:Monsterextractie: Zet een BSL2/3-kast/handschoenenkastje op om biologisch materiaal te verwerken en inactivatie en RNA-extractie uit te voeren. Sjabloongebied: Richt een BSL1-kast/handschoenenkastje in voor de toevoeging van sjabloon (RNA/cDNA) aan de vooraf voorbereide reactiemastermix. Master mix area: Richt een aangewezen clean area in (BSL1 kast/handschoenenkastje) voor de bereiding van reagens master mixen. Er zou geen sjabloon in dit gebied moeten zijn. Post-PCR-gebied: Richt een aparte ruimte in voor het werken aan amplicons en het opstellen van sequencing-bibliotheken.NOTITIE: Alle gebieden moeten voor en na gebruik worden gereinigd met een oppervlakteontsmettingsmiddel en ultraviolet (UV) worden gesteriliseerd. 5. Monstername en diagnose in het veld NOTITIE: Monsters moeten worden verzameld door opgeleid en geïmmuniseerd personeel dat persoonlijke beschermingsmiddelen draagt en de genoemde standaardprocedures47,48,49 volgt. Verzamel het monster via het foramen magnum (d.w.z. de occipitale route), zoals in detail beschreven in Mauti et al.50. Diagnose van rabiës in het veld met snelle diagnostische tests en bevestig in het laboratorium met behulp van aanbevolen procedures47, zoals de directe fluorescerende antilichaamtest (DFA), de directe snelle immunohistochemische test (DRIT)51,52 of realtime reverse transcriptie (RT)-PCR53. Gebruik bevestigde positieve hersenmonsters voor RNA-extractie of bewaar ze in een vriezer bij -20 °C gedurende 2-3 maanden of -80 °C gedurende langere perioden. Bewaar RNA voor opslag en transport met behulp van een geschikt DNA/RNA-stabilisatiemedium. 6. Monstervoorbereiding en RNA-extractie (3 uur) NOTITIE: Gebruik een op spinkolommen gebaseerde virale RNA-extractiekit die geschikt is voor het monstertype. Bereid twee keramische kralenbuisjes voor door een PCR-buisje van 2 ml te vullen met een buisje van ongeveer 200 μl vol met keramische kralen van 1,4 mm en label het buisje. Voeg het aanbevolen volume lysisbuffer in de RNA-extractiekit toe aan de gelabelde PCR-buis. Neem ongeveer een kubus van 3 mm uit het hersenmonster dat is bevestigd met een rabiësinfectie met behulp van een houten applicator en doe het in een gelabelde buis met monster-ID en 100 μL nucleasevrij water in de buis met het label negatieve controle.NOTITIE: Gebruik homogenisatie op basis van gesloten buisparels om de blootstelling van het monster te beperken. Als dit niet mogelijk is, gebruik dan andere geschikte mechanische verstoorders (bijv. op basis van een rotor) of een handmatige microstamper. Deze kunnen echter minder effectief zijn dan het kloppen van kralen op een hard oppervlak om weefsel te verstoren (weefselmonsters kunnen uitharden in bepaalde opslagmedia). Verstoor het hersenweefsel handmatig met behulp van een houten applicatorstick en draai vervolgens op maximale snelheid totdat volledige weefselhomogenisatie is bereikt. Centrifugeer het lysaat volgens de instructies van de fabrikant en gebruik een pipet om het supernatans over te brengen naar een nieuw gelabeld microcentrifugebuisje. Gebruik dit supernatans alleen in de volgende stappen. Volg de instructies voor de spinkolom van de RNA-extractiekit om gezuiverd RNA te verkrijgen. Voeg hier een negatieve extractiecontrole (NEC) toe en ga helemaal door naar de sequencingfase. 7. cDNA-bereiding (20 min) Bereid in het mastermixgebied een mastermix voor de eerste streng cDNA-synthese op basis van het aantal te verwerken monsters en controles (met een overtollig volume van 10% om te zorgen voor voldoende reagens; Tabel 1). In dit stadium moet een no-template control (NTC) worden opgenomen. Label 0,2 ml PCR-stripbuisjes en aliquot 5 μL van het mastermengsel in de buisjes. Breng de voorbereide buizen naar het sjabloongebied. Voeg 5 μL RNA toe aan elke gelabelde buis, inclusief de NEC. Voeg 5 μL nucleasevrij water (NFW) toe aan de NTC. Incubeer in een thermische cycler volgens de in tabel 1 vermelde omstandigheden.OPMERKING: Optioneel pauzepunt: cDNA kan indien nodig maximaal 1 maand bij -20 °C worden bewaard, maar overgaan tot PCR heeft de voorkeur. 8. Voorbereiding van de voorraad van de primerpool (1 uur) OPMERKING: Deze stap is alleen nodig als er nieuwe voorraden worden gemaakt van afzonderlijke primers, waarna vooraf voorbereide voorraadoplossingen kunnen worden gebruikt. Bereid een primerpool van 100 μM bouillon voor in het mastermixgebied. Resuspendeer de gevriesdroogde primers in 1x tris-EDTA (TE)-buffer of NFW in een concentratie van 100 μM elk. Draai grondig en draai naar beneden.OPMERKING: In de volgende stappen worden afzonderlijke primers gescheiden in twee primerpools – oneven genummerd (genaamd Pool A) en even genummerd (genaamd Pool B) – om interacties tussen primers die ampliconoverlappingen flankeren te voorkomen. Deze pools van primers genereren overlappende amplicons van 400 bp die het doelgenoom overspannen. Schik alle oneven genummerde primers in een buizenrek. Genereer een primerpoolvoorraad door 5 μl van elke primer toe te voegen aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml met het label “naam primerschema – Pool A (100 μM)”. Herhaal het proces voor alle even genummerde primers en label als “naam primerschema – Pool B (100 μM)”. Verdun elke primerpool 1:10 in water van moleculaire kwaliteit om primervoorraden van 10 μM te genereren.OPMERKING: Maak meerdere aliquots van 10 μM primerverdunningen en vries deze in in geval van degradatie of vervuiling. 9. Multiplex PCR (5 uur) Bereid twee PCR-mastermixen voor, één voor elke primerpool in het mastermixgebied.Gebruik een eindconcentratie van 0,015 μM per primer. Bereken het vereiste volume van de primerpool voor de PCR-reactie (tabel 2) met behulp van de volgende formule:Primerpoolvolume = aantal primers x reactievolume x 0,015/concentratie (μM) primermateriaal Aliquot 10 μL elk van de hoofdmix van pool A en de mastermix van pool B aan de gelabelde PCR-stripbuisjes in het sjabloongebied. Voeg voor elk monster 2,5 μL cDNA (uit stap 3) toe aan elk van de corresponderende gelabelde primer Pool A- en B-reacties. Overtollig cDNA kan worden opgeslagen bij -20 °C. Meng door zachtjes te tikken en pulscentrifugeer. Incubeer de monsters onder de in tabel 2 vermelde omstandigheden op een PCR-machine.OPMERKING: Het programma bevat geen specifieke uitbreidingsstap vanwege de lange gloeitijd van 5 minuten (vereist vanwege het grote aantal primers) en de korte lengte van de amplicons (400 bp) die voldoende is voor de verlenging. 10. PCR-opschoning en kwantificering (3,5 uur) Voer vanaf dit punt alle werkzaamheden uit in het post-PCR-gebied. Aliquot vaste-fase omkeerbare immobilisatie (SPRI) parels in microcentrifugebuisjes van de hoofdfles. Bewaren bij 4 °C. Verwarm een SPRI-parel aliquot tot kamertemperatuur (RT; ~20 °C) en draai grondig totdat de korrels volledig in de oplossing zijn geresuspendeerd. Combineer in buisjes van 1,5 ml de primer Pool A en primer Pool B PCR-producten voor elk monster. Voeg indien nodig water toe om het volume op 25 μL te brengen. Voeg 25 μL SPRI-korrels toe aan elk monster (1:1 kraal:monsterverhouding). Meng door op en neer te pipetteren of zachtjes op de buis te tikken. Incubeer gedurende 10 minuten bij RT, waarbij u af en toe de buizen omkeert of tikt. Plaats op een magnetisch rek totdat de kralen en de oplossing volledig zijn gescheiden. Verwijder het supernatant en gooi het weg, zorg ervoor dat u de kralenpellet niet verstoort. Was twee keer met 80% ethanol (opgewarmd tot RT).Voeg 200 μL ethanol toe aan de pellet. Wacht 30 s om ervoor te zorgen dat de kralen goed worden gewassen. Verwijder de supernatant voorzichtig en gooi deze weg, waarbij u probeert de kralenpellet niet aan te raken. Herhaal stap 10.8.1-10.8.2 om de pellet een tweede keer te wassen. Verwijder alle sporen van ethanol met een tip van 10 μL. Aan de lucht laten drogen totdat het spoor van ethanol is verdampt (met kleine bolletjes gebeurt dit snel, ~30 s); Wanneer dit gebeurt, moet de pellet van glanzend naar mat gaan. Zorg ervoor dat u niet te droog bent (als de pellet barst, is deze te droog), omdat dit het DNA-herstel beïnvloedt. Resuspendeer de korrels in 15 μL NFW en incubeer gedurende 10 minuten bij RT (off magnetic rack). Keer terug naar het magnetische rek en breng het supernatans (gereinigd product) over in een verse buis van 1.5 ml. Bereid een verdunning van 1:10 van elk monster in een apart buisje (2 μL product + 18 μL NFW).NOTITIE: Wees in dit stadium zeer voorzichtig om kruisbesmetting te voorkomen. Zorg dat er slechts één ampliconbuis tegelijk open staat. Aliquot 18 μL water eerst in de buizen (in een schoon mastermixgebied). Meet de DNA-concentratie van elk verdund monster met behulp van een zeer gevoelige en specifieke fluorometer, zoals beschreven in protocols.io54,55. 11. Normalisatie (30 min) Gebruik het normalisatiesjabloon (aanvullend bestand 3) en de DNA-concentratie (ng/μL) van elk monster om het volume verdund (of zuiver) monster te berekenen dat nodig is voor 200 fmol van elk monster in een totaal volume van 5 μL. Label nieuwe PCR-buisjes en voeg berekende volumes NFW en monster toe om genormaliseerd DNA te verkrijgen. Gebruik het berekende volume voor onverdunde (nette) monsters als er meer dan 5 μL van het verdunde monster nodig is om 200 mmol te verkrijgen.NOTITIE: Optioneel pauzepunt: Op dit punt kan het gereinigde PCR-product maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard of indien nodig bij -20 °C worden geplaatst voor langdurige opslag. 12. Eindvoorbereiding en barcodering (1,5 uur) OPMERKING: De volgende stappen gaan uit van het gebruik van specifieke reagentia uit nanoporie-specifieke barcode- en ligatiesequencingkits (zie Tabel met materialen voor details). Het protocol is overdraagbaar tussen verschillende chemische versies, maar gebruikers moeten ervoor zorgen dat ze compatibele kits gebruiken, volgens de instructies van de fabrikant. Eindreparatie en dA-tailingStel de eindreactie in voor elk monster dat in tabel 3 wordt genoemd. Bereid een mastermix voor op basis van het aantal monsters (plus 10% overschot). Wees voorzichtig bij het pipetteren, aangezien de reagentia stroperig zijn. Voeg 5 μL mastermix toe aan elk buisje genormaliseerd DNA (5 μL). Het totale reactiemengsel moet 10 μL zijn. Vervang de tips elke keer en laat slechts één buis tegelijk open. Incubeer in een thermische cycler onder de in tabel 3 vermelde omstandigheden. StreepjescodesAliquot de streepjescodes van de barcodekit naar PCR-stripbuisjes bij 1,25 μL/buisje en noteer de streepjescode die aan elk monster is toegewezen. Voeg 0,75 μl van het eindgeprepareerde monster toe aan het toegewezen streepjescode-aliquot. Bereid een ligatiemastermix op basis van het aantal monsters (plus 10% overschot) (tabel 4). Voeg 8 μL ligatiemastermix toe aan het eindgeprepareerde monster + barcodes, waardoor een totale reactie van 10 μL ontstaat. Incubeer in een thermische cycler onder de in tabel 4 vermelde omstandigheden. SPRI kralen opruimen en DNA kwantificeringOntdooi de korte fragmentbuffer (SFB) bij RT, meng door vortexen, pulscentrifugeer en plaats op ijs. Verzamel alle monsters met streepjescode samen in een lobind microcentrifugebuisje van 1,5 ml. Om het opruimvolume niet te groot te maken om te gebruiken, bundelt u 12-24 monsters (10 μL/monster), maximaal 48 monsters (5 μL/monster) of maximaal 96 monsters (2,5 μL/monster) van elke native barcodereactie. Voeg een 0,4x volume SPRI-kralen toe aan de pool met streepjescode. Meng voorzichtig (flikkeren of pipetteren) en incubeer 5 minuten bij RT. Plaats de monsters op een magneet totdat de kralen zijn gepelleteerd en het supernatans volledig helder is (~2 min). Verwijder het supernatant en gooi het weg. Zorg ervoor dat u de kralen niet verstoort. Tweemaal wassen met 250 μL SFB.Verwijder de buis van de magneet en resuspendeer de pellet volledig in 250 μL SFB. Incubeer gedurende 30 s, pulscentrifugeer en keer terug naar de magneet. Verwijder het supernatans en gooi het weg. Herhaal stap 12.3.5 om een tweede SFB-wasbeurt uit te voeren. Pulscentrifugeer en verwijder eventuele resterende SFB. Voeg 200 μL 80% (RT) ethanol toe om de pellet te wassen. Verwijder de ethanol en gooi deze weg, zorg ervoor dat u de parelkorrel niet verstoort. Laat 30 s aan de lucht drogen of totdat de pellet zijn glans heeft verloren. Resuspendeer in 22 μL NFW bij RT gedurende 10 min. Plaats op de magneet, laat ~2 minuten bezinken, verwijder dan voorzichtig de oplossing en breng over naar een schone microcentrifugebuis van 1.5 ml. Gebruik 1 μL om de DNA-concentratie te verkrijgen, zoals eerder beschreven (stap 10.13).OPMERKING: Optioneel pauzepunt: Op dit punt kan de bibliotheek worden opgeslagen bij 4 °C gedurende maximaal 1 week of -20 °C voor opslag op langere termijn, maar het verdient de voorkeur om door te gaan met adapterligatie en sequencing. 13. Sequencing (maximaal 48 uur) Bereid de computer voor (zie ook de secties Vereisten 1-4).Controleer of er voldoende ruimte is om nieuwe gegevens op te slaan (min. 150 GB), of er een back-up is gemaakt van de gegevens van oude uitvoeringen/naar een server wordt verplaatst voordat ze worden verwijderd, en of de nieuwste versie van MinKNOW is geïnstalleerd. Haal de opgeslagen stroomcel uit de koelkast en laat deze RT bereiken. Adapter ligatie (1 uur)Pulscentrifugeer het adaptermengsel en ligase en plaats op ijs. Ontdooi elutiebuffer (EB), SFB en ligatiebuffer bij RT. Meng door vortexen, pulscentrifugeer en plaats op ijs. Bereid de mastermix voor het afbinden van de adapter (tabel 5) voor, waarbij de reagentia in de aangegeven volgorde worden gecombineerd in een buis met lage binding.OPMERKING: Afhankelijk van de beschikbaarheid in het laboratorium kunnen alternatieven voor adapterligatiemastermixreagentia (tabel 5) worden gebruikt. Zie Aanvullend Dossier 3 en Tabel van Materialen voor een lijst van alternatieven. Gebruik berekeningen in het werkblad Aanvullend bestand 3 om het volume van de DNA-bibliotheek gelijk te krijgen aan 200 fmol. Als er minder dan 20 μl wordt berekend, voeg dan NFW toe om tot 20 μl te komen. Meng door zachtjes te tikken en pulscentrifugeer. Incubeer bij RT gedurende 20 min.OPMERKING: Begin tijdens de incubatie met het voorbereiden van de stroomcel (paragraaf 13.5). Reinig met SPRI-korrels (gebruik geen ethanol zoals bij eerdere schoonmaakbeurten).Voeg een 0,4x volume SPRI kralen (RT) toe aan de monsters. Incubeer 10 minuten bij RT, tik zachtjes met tussenpozen om het mengen te vergemakkelijken. Plaats op de magneet totdat de kralen en de oplossing volledig zijn gescheiden (~5 min). Verwijder de supernatant en gooi deze weg; Zorg ervoor dat u de kralenkorrel niet verstoort. Tweemaal wassen met 125 μL SFB. Resuspendeer de pellet volledig met 125 μL SFB door te mengen met een pipet. Laat 30 s incuberen. Pulscentrifuge om vloeistof op te vangen aan de basis van de buis en op de magneet te plaatsen. Verwijder het supernatans en gooi het weg. Herhaal stap 13.4.4-13.4.5 om de pellet een tweede keer te wassen. Pulscentrifugeer en verwijder overtollige SFB. Resuspendeer in 15 μL EB en incubeer gedurende 10 minuten bij RT. Keer terug naar de magneet gedurende ~2 minuten en breng de oplossing vervolgens voorzichtig over in een schone microcentrifugebuis van 1.5 ml. Kwantificeer 1 μL van de geëlueerde bibliotheek, zoals eerder beschreven in stap 10.13OPMERKING: Ga voor de beste resultaten direct verder met MinION-sequencing; de uiteindelijke bibliotheek kan echter indien nodig maximaal 1 week in EB bij 4 °C worden bewaard. Voer een kwaliteitscontrole van de stroomcel uit.Sluit het sequencing-apparaat aan op een laptop en open de sequencing-software. Selecteer het type stroomcel en klik vervolgens op Stroomcel controleren en test starten. Eenmaal voltooid, wordt het totale aantal actieve (d.w.z. levensvatbare) poriën weergegeven. Een nieuwe flowcel moet >800 actieve poriën hebben; Als dit niet het geval is, neem dan contact op met de fabrikant voor een vervanging. Vullen en laden van de flowcel (20 min)Ontdooi de volgende reagentia bij RT en plaats vervolgens de sequencingbuffer, een spoelketting, spoelbuffer en laadparels op ijs. Draai de sequentiebuffer en spoelbuffer vortex, pulscentrifugeer en plaats op ijs. Pulscentrifugeer de spoelketting en meng door te pipetteren; Leg ze vervolgens op ijs. Bereid de flow cell priming mix voor door 30 μL flush tether rechtstreeks toe te voegen aan de buis van de flush buffer uit een flow cell priming kit en meng door te pipetteren. Meng de laadparels door direct voor gebruik te pipetteren, omdat ze snel bezinken. Bereid in een nieuwe tube de laatste bibliotheekverdunning voor sequencing voor, zoals vermeld in tabel 5.OPMERKING: Gebruik berekeningen in het werkblad Aanvullend bestand 3 om het volume van de DNA-bibliotheek gelijk aan 50 mmol te krijgen. Als er minder dan 12 μl wordt berekend, voeg dan EB toe om tot 12 μl te komen. Klap het deksel van het sequencingapparaat terug en schuif het deksel van de aanzuigpoort met de klok mee zodat de aanzuigpoort zichtbaar is (Figuur 3) Verwijder luchtbellen voorzichtig door een P1000-pipet in te stellen op 200 μL, steek de punt in de aanzuigpoort en draai aan het wiel totdat een klein volume de pipetpunt binnenkomt (max. draaien naar 230 μL). Laad 800 μL flowcel-primingmix in de flowcel via de priming-poort, zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Laat 5 minuten intrekken. Til het deksel van de monsterpoort voorzichtig op en laad 200 μL aanzuigmengsel in de stroomcel via de aanzuigpoort met behulp van een P1000-pipet. Pipeteer de bibliotheekmix op en neer voordat u deze laadt, en zorg ervoor dat de laadparels in de mastermix opnieuw worden gesuspendeerd voordat u deze laadt. Laad 75 μL bibliotheekmengsel druppelsgewijs in de stroomcel via de monsterpoort. Zorg ervoor dat elke druppel in de poort stroomt voordat u de volgende toevoegt. Plaats het deksel van de monsterpoort voorzichtig terug en zorg ervoor dat de stop in de monsterpoort komt. Sluit de ontluchtingspoort en plaats het deksel van het sequencingapparaat terug. Sequentiereeks (maximaal 48 uur)Sluit het sequencing-apparaat aan op de laptop en open de sequencing-software. Klik op start en klik vervolgens op Sequencing starten. Klik op Nieuw experiment en volg de GUI-werkstroom (Graphical User Interface) van de sequencingsoftware om de parameters voor de uitvoering in te stellen. Typ de naam van het experiment en de voorbeeld-id (bijvoorbeeld rabv_run1) en kies het type stroomcel in de vervolgkeuzelijst. Ga verder met het selecteren van de kit en kies de relevante ligatiesequencingkit en native barcodekit(s) die worden gebruikt. Ga door met opties voor uitvoeren . Behoud de standaardinstellingen, tenzij het gewenst is dat de run automatisch stopt na een bepaald aantal uren (runs kunnen op elk moment handmatig worden gestopt). Ga verder naar Basecalling. Kies ervoor om Basecalling in of uit te schakelen, afhankelijk van de computerbronnen (zie computerinstellingen). Kies Opties bewerken onder streepjescode en zorg ervoor dat Barcode Both Ends is ingeschakeld. Sla op en ga verder naar het uitvoergedeelte. Accepteer de standaardinstellingen en ga verder met de laatste beoordeling, controleer de instellingen en noteer de details in het werkblad (aanvullend bestand 3). Klik op Start.NOTITIE: Als de stroomcel opnieuw wordt gebruikt, pas dan de startspanning aan (in het geavanceerde gedeelte van de run-opties), zoals aangegeven door het schema in aanvullend bestand 3. Noteer de eerste actieve kanalen – als dit aanzienlijk lager is dan de kwaliteitscontrole (QC), start u de sequencing-software opnieuw. Als het nog steeds lager is, start u de computer opnieuw op. Noteer de initiële kanalen in streng versus enkele porie om een geschatte poriebezetting te geven. Dit aantal zal fluctueren, dus geef een benadering. Houd de uitvoering in de gaten naarmate deze vordert. 14. Live en offline basecalling OPMERKING: Deze instructies gaan ervan uit dat de reeds bestaande mappenstructuur in de artic-rabv-repository is opgenomen en dat de secties 1 en 3 van het protocol zijn gevolgd. Maak op uw lokale bestandssysteem een nieuwe map met de naam analyse, waarin u al uw analyse-uitvoer opslaat. Om verder te organiseren: maak een submap met de naam van uw project en daarbinnen een nieuwe map voor de run, met behulp van de voorbeeld-ID die aan de MinKNOW is verstrekt als de run_name. Doe dit in één commando als volgt:mkdir -panalyse/project_name/run_nameNavigeer vervolgens naar de locatie:cdpad/analyse/project_name/run_name Live honkbellenOPMERKING: Om nanopore basecalling in realtime uit te voeren, hebben laptops een NVIDIA CUDA-compatibele grafische verwerkingseenheid (GPU) nodig. Zorg ervoor dat de instructies voor het instellen van de GPU-basisoproep zijn uitgevoerd met behulp van het guppy-protocol56.Schakel tijdens het instellen van de run live basecalling in. Gebruik RAMPART om de sequencingdekking in realtime te volgen, volgens de onderstaande instructie. Activeer in de terminal van de computer de artic-rabv conda-omgeving:Conda activeren Artic-rabv Maak een nieuwe map voor de waluitvoer in de run_name map en navigeer ernaartoe:cd /pad/analyse/project_name/run_nameMKDIR rampart_outputcd rampart_output Maak een bestand .csv streepjescodes om de streepjescodes en voorbeeldnamen te koppelen. Het moet één regel per streepjescode hebben en alleen streepjescodes specificeren die in de bibliotheek aanwezig zijn, met de kopjes “streepjescode” en “voorbeeld”. Volg het voorbeeld in de artic-rabv directory:analyse/example_project/example_run/rampart_output/barcodes.csv Start RAMPART door de relevante protocolmap en het pad naar de fastq_pass map in de MinKNOW-uitvoer voor de uitvoering op te geven:rampart –protocol /path/rampart/scheme_name_V1_protocol – basecalledPath Open een browservenster en navigeer naar localhost:3000 in het URL-vak. Wacht tot er voldoende gegevens zijn gecalld voordat de resultaten op het scherm verschijnen. Offline basecalling (uitgevoerd na het hardlopen)Als live basecalling niet is ingesteld, is de uitvoer van MinKNOW onbewerkte signaalgegevens (fast5-bestanden). Men zal RAMPART niet kunnen gebruiken tijdens de run. Converteer de fast5-bestanden naar basecall-gegevens (fastq-bestanden) na het uitvoeren met behulp van guppy (zie setup in Vereisten stap 1.1.1.). Voer RAMPART post-hoc uit op de basisaangeroepen gegevens. Voer de guppy basecaller uit:guppy_basecaller -c dna_r9.4.1_450bps_fast.cfg -i /path/to/reads/fast5_* -s /path/analysis/project_name/run_name -x auto -r-c is het configuratiebestand om het basecall-model te specificeren, -i is het invoerpad, -s is het opslagpad, -x specificeert basecalling door het GPU-apparaat (exclusief als de computerversie van guppy wordt gebruikt) en -r specificeert het recursief zoeken naar invoerbestanden.OPMERKING: Het configuratiebestand (.cfg) kan worden gewijzigd in een zeer nauwkeurige basecaller door _fast te vervangen door _hac, hoewel dit aanzienlijk langer zal duren. 15. Wassen van de flowcellen De flowcellen kunnen worden gewassen en hergebruikt om nieuwe bibliotheken te sequencen als de poriën nog levensvatbaar zijn. Zie instructies voor het wassen bij het ONT-wasprotocol57 voor stroomcellen. 16. Analyse en interpretatie Consensussequentiegeneratie met ARTIC-bioinformaticapijplijnVolg de instructies in de artic-rabv GitHub repository40 in de map rabv_protocols om consensussequenties te genereren van raw fast5 of basecalled fastq bestanden.OPMERKING: Raadpleeg Artic pipeline – Core pipeline58 voor meer informatie. Optioneel: Analyseer de gemiddelde leesdiepte per amplicon.Pas de scripts aan die beschikbaar zijn in de artic-rabv-repository, verwijzend naar aanvullend bestand 1. In het kort worden diepgaande statistieken gegenereerd met behulp van SAMtools59 en dekking per nucleotide uitgezet in R. Fylogenetische analyse met behulp van GLUESelecteer in RABV_GLUE42 het tabblad Analyse > het tabblad Genotypering en interpretatie > Bestanden toevoegen en selecteer het fasta-bestand met consensussequenties. Klik op Verzenden en wacht. Zodra de analyses zijn voltooid, is de knop Analyse weergeven beschikbaar om op te klikken, met klade- en subcladetoewijzingen, dekking per gen, variatie ten opzichte van referentiesequenties en naaste verwant. Relevante contextuele sequenties kunnen ook worden geïdentificeerd in de sectie Sequentiegegevens > NCBI-sequenties per clade . Selecteer de geïdentificeerde clade of klik op Rabiësvirus (RABV) om alle beschikbare sequenties te zien. Filter op relevante sequenties (bijv. land van herkomst). Download deze sequenties en bijbehorende metadata voor analyse en vergelijking. Afstammingstoewijzing met behulp van MADDOG41Haal de MADDOG-repository uit GitHub om er zeker van te zijn dat u met de meest up-to-date versie werkt. Maak een toewijzingsmap in de lokale MADDOG-opslagplaats (eerder gemaakt in de sectie Vereisten) met de naam van de uitvoering. Voeg in de map het fasta-bestand toe met de consensussequenties. Voeg een metadatabestand toe aan de map.OPMERKING: Dit bestand moet een csv zijn met 4 kolommen met de naam ‘ID’, ‘land’, ‘jaar’ en ‘toewijzing’, met details over de sequentie-ID’s, het land van bemonstering en het jaar van monsterverzameling, terwijl de kolom ‘toewijzing’ leeg moet zijn. Activeer in de opdrachtregelinterface de conda-omgeving: conda activeer MADDOG. Navigeer in de opdrachtregelinterface naar de map MADDOG-opslagplaats. Voer in eerste instantie de afstammingstoewijzing uit op sequenties om te controleren op mogelijke afwijkingen en om te bepalen of het uitvoeren van de langere afstammingsaanduidingsstap geschikt zou zijn. Typ hiervoor dit in de opdrachtregel: sh assignment.sh. Wanneer daarom wordt gevraagd, voer je Y in om aan te geven dat je de repository hebt opgehaald en werkt met de meest up-to-date versie van MADDOG. Voer desgevraagd de naam in van de map in de MADDOG-opslagplaatsmap die het fasta-bestand bevat. Wanneer de herkomsttoewijzing is voltooid, controleert u het uitvoerbestand in uw map. Als de uitvoer is zoals verwacht en er meerdere sequenties zijn toegewezen aan dezelfde herkomst, voert u de herkomstaanduiding uit. Als u de herkomstaanduiding uitvoert, verwijdert u het zojuist gemaakte uitvoerbestand van de opdracht. Voer in de terminal, in de map van de MADDOG-repository, het commando sh designation.sh uit. Wanneer daarom wordt gevraagd, voert u Y in om aan te geven dat u de repository hebt opgehaald en met de meest up-to-date versie van MADDOG werkt. Voer desgevraagd de mapnaam in de MADDOG-repositorymap in met het fasta-bestand en de metadata. Dit levert afstammingsinformatie op over elke sequentie, een fylogenie van de nieuwe en relevante eerdere sequenties (vanaf 16.3.6), hiërarchische informatie over de afstammingslijnen en details van mogelijk opkomende afstammingslijnen en gebieden van onderbemonstering.OPMERKING: Volledige details van het protocol, het gebruik en de uitvoer zijn te vinden in Campbell et al.60. Wanneer de eerste analyse is voltooid, voert u Y in als u wordt gevraagd om ook te testen op opkomende en onderbemonsterde afstammingslijnen, indien dit vereist is. Voer anders N in. Als u wordt gevraagd om nieuw gevonden afstammingslijnen te bevestigen, voert u Y in en volgt u de instructies in het resulterende NEXT_STEPS.eml-bestand. Voer anders N in.