在成像微孔板中使用预制聚乙二醇（PEG）水凝胶简单建立血管化成骨骨髓壁龛

图 1 总结了以下协议部分。 1. 建立3D基质单一栽培 准备hBM-MSC细胞悬液。在补充有 10% FBS、1% 青霉素-链霉素和 5 ng/mL FGF-2 的培养箱中，在 37 °C 和 5% CO2 的培养箱中将 hBM-MSC 生长至 70%-90% 的汇合水平。细胞可以使用至第6代。 用PBS洗涤细胞，并在37°C下用0.05%胰蛋白酶-EDTA分离3-5分钟。 通过用基础培养基冲洗（补充有10S和1%青霉素链霉素的MEMα）停止分离过程。将悬浮细胞收集在 50 mL 锥形离心管中。 使用血细胞计数器或自动细胞计数器对细胞进行计数，并确定悬浮液中的细胞总数。 通过以200× g 离心5分钟来沉淀细胞。小心地除去上清液。 将细胞重悬于适当体积的基础培养基中，以达到 1 x 107 个细胞/mL 储备溶液的浓度。 制备 50 mL 锥形离心管，其中包含所需体积的基础培养基，并补充有相应的生长因子（定义浓度的 FGF-2 和 BMP-2，例如 0 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 或 200 ng/mL）。每孔需要 200 μL。如果要使用自动液体处理器进行细胞接种，还要考虑仪器的死体积。对于手动细胞接种，体积超过10%就足够了。 从储备溶液中加入 hBM-MSC，稀释度为 1：66.67，以达到 1.5 x 105 个细胞/mL 的浓度。 准备用于播种的板。去除覆盖在96孔水凝胶板上的聚丙烯粘合剂膜。 小心地吸出覆盖水凝胶的储存缓冲液。对于此任务，请使用微孔板清洗机;但是，可以手动处理。使用手动吸气器或多通道移液器时，将吸头靠在孔壁上，并在吸出缓冲液的同时缓慢向下向内孔边缘移动。这将避免损坏水凝胶表面。 使用自动洗板机时，将吸液喷嘴设置在距离板载体至少3.8 mm（这相当于距离水凝胶板内环0.8 mm）和孔边缘的位置。有关更详细的说明，请参阅制造商手册，并获得96孔水凝胶板的板图。 充分混合后，加入步骤1.1.7中制备的细胞悬液的200μL/孔，以确保细胞均匀分布。在接种过程中，为避免细胞在底物的一个区域中不均匀沉降，请勿倾斜板。对于手动接种，定期混合细胞悬液（接种三个孔后）以保持混合物均匀。对于自动接种，在分液前立即与血清移液管混合，以便分液含有相同数量细胞的体积。 在潮湿气氛中将培养物保持在37°C和5%CO2 。 根据需要使用5倍物镜的明场显微镜监测培养物的发展。接种后约30分钟获取参考图像以评估添加的细胞数量。 2. 建立3D基质-内皮细胞共培养 准备GFP-HUVEC细胞悬液。通过在37°C下涂上由150μg/ mL大鼠尾胶原蛋白I在0.02M乙酸中包被30分钟的溶液来制备用于HUVEC培养的烧瓶。 使用前用PBS冲洗一次。 在补充有10S的EGM-2中将GFP-HUVECs生长至80%-100%的汇合水平，在37°C的培养箱中，在加湿气氛中补充5%CO2 。细胞可以使用至第7代。 用PBS洗涤细胞，并在37°C下用0.05%胰蛋白酶-EDTA分离2-3分钟。 通过用基础培养基冲洗（补充有10S和1%青霉素链霉素的MEMα）停止分离过程。将悬浮细胞收集在 50 mL 锥形离心管中。 使用血细胞计数器或自动细胞计数器对细胞进行计数，并确定悬浮液中存在的细胞总数。 通过以200× g 离心5分钟来沉淀细胞。小心地除去上清液。 将细胞重悬于适当体积的基础培养基中，以达到 1 x 107 个细胞/mL 储备溶液的浓度。 制备 50 mL 锥形离心管，其中包含所需体积的基础培养基，并补充有相应生长因子（定义浓度的 FGF-2 和 BMP-2，例如 0 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 或 200 ng/mL），如步骤 1.1.6 中对 hBM-MSC 中所述。 从储备溶液中加入 GFP-HUVEC 以 1：66.67 的稀释度达到 1.5 x 105 个细胞/mL 的浓度，如步骤 1.1.7 中对 hBM-MSC 所述。 从含有基质单一培养物的平板中吸出培养基，如步骤1.2.2中所述的缓冲液去除。 加入步骤2.1.8中制备的GFP-HUVEC细胞悬液的200μL /孔，如步骤1.3中hBM-MSC添加中所述。 在37°C和5%CO2 在潮湿气氛中孵育。每3-4天更换一次培养基。 根据需要使用5倍物镜通过明场和荧光显微镜监测培养物的发展。将培养物维持到共培养的第 4 天或第 7 天，分别进行早期或中期表征，或根据需要进行。 3. 表征程序 1：定量内皮细胞网络的形成 在所需的时间点，使用适合定量的设置（即，最佳聚焦、高对比度和低放大倍率 [例如，5x] 用于更大视场）使用荧光显微镜从 GFP-HUVEC 获取 GFP 信号。 对同一天获得的所有图像进行均匀的预处理（例如，使用斐济32）以进一步增强对比度。请注意，GFP信号可能会随着培养时间而变暗;因此，在不同日期采集的图像可能需要不同的处理。如果使用 Fiji 或 ImageJ，请打开同一时间点的所有 GFP 通道图像，然后打开 “亮度和对比度 ”菜单。选择代表中间条件（不是最暗的信号，也不是最亮的信号）的图像，然后通过选择“自动”自动来 自动调整对比度。选择“ 设置”，然后选中 “传播到所有其他打开的映像”。 直观地评估自动选择的范围是否适合当前时间点的所有图像，并根据需要手动重新调整并重新传播到所有图像。 将调整后的图像另存为TIF文件，并对获取的其他时间点重复步骤3.2.1和步骤3.2.2。 对所有图像应用中值模糊滤镜（例如，半径 3 表示 2048×2048 图像），以避免下游伪影识别，从而促进准确的网络识别。通过合并 （2×2） 减小大小，并将所有预处理的图像保存为文件夹中的灰度 RGB 颜色 TIF 文件以进行量化。这些步骤可以手动完成，也可以使用作者将根据请求共享的宏以批处理模式完成。 使用 ImageJ33 血管生成分析仪中的批处理模式分析在步骤 3.1-3.3 中创建的文件夹中的所有图像。请注意，根据图像的大小和可用的工作内存，每个图像可能需要几分钟的时间。 通过检查识别结构和原始图像的叠加来验证量化结果。如果算法识别出人工结构，在原始图像中只能看到很少或没有细胞，则调整预处理参数，并重新分析原始图像，或从分析中排除此类问题区域和/或复制图像。 通过将每个样品的值乘以分析面积与 1 mm 2 的比率，将获得的值归一化为 1 mm2 的面积。如果使用不同大小的图像，此步骤尤其重要。 从分析中提取各种网络参数，例如总网络长度、交汇点数、段数、隔离段数、分支间隔和平均网格大小，并使用它们来表征不同时间点和不同培养条件下的内皮网络。 4. 表征程序 2：评估 ECM 沉积 在所需的终点时间点，使用免疫荧光评估ECM沉积。在培养的最后6小时或固定后，在100μL培养基中添加针对各种ECM分子的一抗，如下所述。在室温下用200μL /孔的PBS洗涤培养物5分钟，并在室温下用100μL /孔的4%多聚甲醛在化学通风橱下固定30分钟。 请注意，建议同时固定板的所有孔，因为在此过程中可能会损坏周围的培养物。用200μL/孔的PBS在室温下洗涤固定培养物三次，每次5分钟，并在4°C下储存在200μL/孔的PBS中，或立即进行下一步。 在固定后与针对ECM分子的一抗孵育之前，将固定培养物与PBS中的200μL /孔的1%BSA作为封闭溶液在室温下孵育30分钟。吸出封闭溶液，并在 4 °C 下与 100 μL/孔的一抗溶液在 PBS 中的 1% BSA 中孵育过夜。 在室温下分别用 200 μL /孔的 PBS 洗涤 3 次 5 分钟、至少 3 小时和 5 分钟。注意：未结合的抗体从水凝胶中完全扩散出来需要很长的洗涤步骤。 为了促进二次染色溶液（包括细胞内复染剂）的渗透，根据培养物的细胞密度，在PBS中使用0.3%Triton X-100和1%BSA在室温下透化培养物30-90分钟。注意：对于细胞内分子的基于抗体的染色，此步骤应在与步骤4.1.2中所述的一抗孵育之前进行。 根据需要制备含有相应二抗和复染剂的二级染色溶液（例如，核染色剂，例如DAPI和细胞骨架染色剂，例如鬼笔环肽-罗丹明）。制备由 0.1% Triton X-100、1% PBS 中的 BSA 和复染剂（例如 1 μg/mL DAPI 和 1：4,000 鬼笔环肽-罗丹明）组成的染色缓冲液，并以推荐的稀释度添加相应的二抗。 加入 100 μL/孔的二次染色溶液，并在 4 °C 下孵育过夜。 与一抗孵育后的程序类似，在室温下分别用200μL/孔的PBS洗涤3次5分钟，至少3小时和5分钟。 对于结构的3D分辨率，从玻璃底部开始采集共聚焦堆栈，z步长为2.5μm，最终高度为500μm，使用10倍物镜和0.75倍数码变焦。要在斐济生成GFP和F-肌动蛋白信号的3D重建，请在创建复合并使用斐济3D查看器生成重建之前分别对每个通道进行阈值。 为了可视化免疫染色沉积的ECM，使用5μm的z步长，10倍物镜和1.5倍数字变焦获取高度为100μm的共聚焦堆栈。在创建合成之前，生成最大强度投影，并分别调整斐济每个通道的亮度和对比度。 对细胞外环境进行直接颜色染色。向多聚甲醛固定孔中加入200μL /孔的Picrosirius Red染色溶液，并在室温下孵育1小时。 接下来，用蒸馏水洗涤染色孔五次，然后每天或每隔一天洗涤两次，持续3-4天，同时监测样品颜色清除。在漫长的洗涤步骤中将板保持在4°C（即超过6小时的任何内容）。 使用配备彩色相机的明场显微镜采集染色样品的图像，并在各种条件下保持相等的白平衡。要获得样品的概览，请使用低放大倍率（例如，2.5倍）扫描整个孔。如果显微镜没有附带支持自动拼接的软件，请手动进行（例如，在斐济34中使用成对拼接）。注意：以前用于免疫荧光的孔可用于此目的，前提是完成荧光图像采集。 按照步骤4.2.1-4.2.3中描述的Picrosirius Red染色的相同步骤进行茜素红染色，洗涤和成像。 5. 表征程序 3：通过监测 ALP 活性评估成骨分化 在不同的培养结束时间点（例如，共培养的第4天和第7天），使用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯（BCIP）/硝基蓝四唑（NBT）染色定量评估ALP活性。在与 BCIP/NBT 底物溶液孵育之前，用 200 μL/孔的 PBS 洗涤培养物一次，应按照制造商的说明制备。在37°C孵育，同时定期监测颜色发展。一旦颜色开始在非成骨条件下发展，立即用200μL/孔的PBS洗涤一次，然后用4%多聚甲醛固定，如步骤4.1.1中所述。 获取染色样品的彩色图像，如步骤4.2.3中所述的Picrosirius Red染色。 在不同的培养结束时间点（例如，共培养的第4天和第7天），量化细胞裂解物中的ALP活性。用200μL/孔的PBS洗涤培养物三次，然后在37°C下与200μL/孔的0.25%胰蛋白酶-EDTA孵育。 每10分钟，通过剧烈上下移液搅动培养物以促进消化，并用标准细胞培养显微镜监测培养物形态。 一旦获得孔中没有细长细胞结构的液体单细胞悬液（通常在20-30分钟后），将样品转移到2mL管中，加入200μLMSC基础培养基以抑制胰蛋白酶，并以500× g 离心5分钟以沉淀回收的细胞。倒出上清液，并将沉淀在-80°C冷冻，或直接进行步骤5.2.3。 解冻在步骤5.2.2中获得的细胞沉淀，并与500μL由0.56M 2-氨基-2-甲基-1-丙醇，0.2%Triton X-100，pH 10组成的裂解缓冲液在冰上孵育30分钟。接下来，在4°C下以16,100× g 离心10分钟，并将样品保持在冰上。在步骤5.2.7中描述的测量之后，将样品冷冻在-20°C或-80°C，或直接继续DNA定量，如步骤5.2.8中所述。注意：裂解缓冲液可以提前制备，无菌过滤，并储存在4°C。 在裂解缓冲液中制备由 20 mM 4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物和 4 mM MgCl2 组成的 ALP 试剂。注意：最好在定量当天新鲜制备此溶液。 在不干扰任何沉淀碎片的情况下，将步骤5.2.3中制备的50μL细胞裂解物上清液一式两份分配到标准透明组织培养96孔板的孔中。将裂解缓冲液作为空白对照添加到两个孔中。 使用多通道移液器，向步骤5.2.5中填充的孔中加入50μL/孔的ALP试剂。短暂摇动板，并在37°C下避光孵育10分钟。具有较高ALP活性的孔将显示为黄色。使用多通道移液器加入 100 μL/孔的 1 M NaOH 停止反应。 使用酶标仪读取410nm处的光密度。平均技术重复项，并减去空白控件的平均值。 执行DNA定量以根据总细胞数对先前步骤中确定的ALP活性进行标准化。这里描述了一种基于荧光测量的方法，但细胞裂解物中DNA定量的任何其他方法都与测定兼容。根据制造商的说明，使用市售试剂盒制备DNA定量所需的试剂和DNA标准品。注意：建议使用裂解缓冲液制备DNA标准品。 如果将步骤5.2.3中描述的用于ALP定量的样品冷冻，则解冻它们，在4°C下以16,100× g 离心2分钟，然后将它们放在冰上。在不干扰任何沉淀碎片的情况下，将 50 μL 细胞裂解物上清液一式两份分配到黑色 96 孔板的孔中。将样品冷冻在-20°C或-80°C，必要时重复ALP和DNA定量。添加一式两份的DNA标准品。 使用多通道移液器，加入 50 μL DNA 染色剂，孵育，并按照制造商的说明读取荧光强度。使用标准曲线值，确定并应用测量强度值到DNA浓度的转换。 通过将步骤5.2.7中获得的ALP值除以每个样品的相应DNA浓度来归一化。 6. 应用1：进行药敏试验 当内皮网络完全发育时（通常在基质-内皮细胞共培养的第4天），在新鲜培养基中的培养物中加入抗血管生成化合物，例如贝伐珠单抗，并测试其随时间和不同条件下的活性（例如，不同浓度的FGF-2或BMP-2）。制备含有与相应培养物相同的生长因子的新鲜培养基，直到这一点。制备由目标化合物的稀释剂组成的对照溶液（例如，贝伐珠单抗：60 mg/mL α-海藻糖二水合物、0.4 mg/mL吐温20、5.8 mg/mL磷酸钠（一水合物和一水合物）和1.2 mg/mL磷酸二水钠），并无菌过滤。 将所需浓度（例如，10μg/mL贝伐珠单抗）的目标化合物和等体积的对照溶液分别添加到指定用于测试条件和对照条件的培养基中。 从培养物中吸出培养基，并加入步骤6.1.1中新鲜制备的培养基的200μL/孔。孵育适合待测化合物的时间（例如，贝伐珠单抗：2 天）。监测培养发育，并表征内皮网络，如第3节所述。使用GFP图像和从步骤3.7中描述的分析中提取的定量网络参数评估化合物在抑制血管生成或烧蚀预成型结构方面的有效性。 7. 应用2：建立与各种癌细胞类型的先进共培养系统 在共培养的第4天，当内皮网络基本建立时，将其他细胞类型（例如MDA-MB-231或U2OS癌细胞）添加到新鲜培养基中的培养物中。按照制造商的说明使用细胞相容的活染料标记癌细胞，以便能够将它们与共培养物中的GFP标记的HUVEC和非标记的hBM-MSC区分开来。 在含有与相应培养物相同的生长因子的新鲜培养基中制备浓度为1.5 x 104 个细胞/ mL的癌细胞悬浮液，直到该点。 根据需要监测培养发育和癌细胞定位。注意：根据癌症类型，活动和环境，它们可能需要几天时间才能到达基质 – 内皮细胞共培养物中的血管结构（例如，MDA-BM-231和U2OS为2天）。因此，应相应地计时以可视化癌细胞相互作用的延时成像。