Geniş bantlı titreşimsel toplam frekans üretimi (VSFG) görüntülerinin yanı sıra parlak alan, ikinci harmonik üretim (SHG) görüntüleme modaliteleri elde etmek için çok modlu, hızlı bir hiperspektral görüntüleme çerçevesi geliştirilmiştir. Kızılötesi frekansın moleküler titreşimlerle rezonans olması nedeniyle, simetriye izin verilen numunelerin mikroskobik yapısal ve mezoskopik morfoloji bilgisi ortaya çıkar.
İkinci dereceden doğrusal olmayan bir optik sinyal olan titreşimsel toplam frekans üretimi (VSFG), geleneksel olarak ~100 μm uzamsal çözünürlüğe sahip bir spektroskopi tekniği olarak arayüzlerdeki molekülleri incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, spektroskopi bir numunenin heterojenliğine duyarlı değildir. Mezoskopik olarak heterojen örnekleri incelemek için, diğerleriyle birlikte, VSFG spektroskopisinin çözünürlük sınırını ~ 1 μm seviyesine kadar zorladık ve VSFG mikroskobunu oluşturduk. Bu görüntüleme tekniği, yalnızca görüntüleme yoluyla örnek morfolojileri çözmekle kalmaz, aynı zamanda görüntülerin her pikselinde geniş bantlı bir VSFG spektrumu kaydeder. İkinci dereceden doğrusal olmayan bir optik teknik olan seçim kuralı, diğerlerinin yanı sıra biyoloji, malzeme bilimi ve biyomühendislikte yaygın olarak bulunan sentrosimetrik olmayan veya kiral kendinden montajlı yapıların görselleştirilmesini sağlar. Bu makalede, izleyiciler, sabitlenmemiş örneklerin görüntülenmesine izin veren ters çevrilmiş bir iletim tasarımı aracılığıyla yönlendirilecektir. Bu çalışma aynı zamanda VSFG mikroskobunun kendi kendine monte edilmiş tabakaların kimyasala özgü geometrik bilgilerini, bir sinir ağı fonksiyon çözücüsü ile birleştirerek çözebileceğini göstermektedir. Son olarak, çeşitli örneklerin parlak alan, SHG ve VSFG konfigürasyonları altında elde edilen görüntüler, VSFG görüntülemenin ortaya çıkardığı benzersiz bilgileri kısaca tartışmaktadır.
İkinci dereceden doğrusal olmayan bir optik teknikolan titreşimsel toplam frekans üretimi (VSFG) 1,2, simetriye izin verilen numuneleri kimyasal olarak profillemek için bir spektroskopi aracı olarak yaygın bir şekilde kullanılmıştır 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Geleneksel olarak, VSFG, VSFG aktivitesi için bir gereklilik olan ters çevirme simetrisinden yoksunolan arayüzey sistemleri 8,9,10,11’e (yani gaz-sıvı, sıvı-sıvı, gaz-katı, katı-sıvı) uygulanmıştır. VSFG’nin bu uygulaması, gömülü arayüzlerin 12,13, arayüzlerde su moleküllerinin konfigürasyonları, 14,15,16,17,18 arayüzlerinde ve 19,20,21,22 arayüzlerinde kimyasal türlerin çok sayıda moleküler detayını sağlamıştır.
VSFG, arayüzlerdeki moleküler türleri ve konfigürasyonları belirlemede güçlü olmasına rağmen, inversiyon merkezleri olmayan malzemelerin moleküler yapılarını ölçme potansiyeli yerine getirilmemiştir. Bunun nedeni kısmen, malzemelerin kimyasal ortamlarında, bileşimlerinde ve geometrik düzenlemelerinde heterojen olabilmesi ve geleneksel bir VSFG spektrometresinin 100μm2 mertebesinde geniş bir aydınlatma alanına sahip olmasıdır. Bu nedenle, geleneksel VSFG spektroskopisi, tipik bir 100μm2 aydınlatma alanı üzerinden numunenin topluluk ortalaması alınmış bilgileri hakkında rapor verir. Bu topluluk ortalaması, zıt yönelimlere sahip iyi düzenlenmiş alanlar arasında sinyal iptallerine ve yerel heterojenliklerin yanlış karakterizasyonuna yol açabilir 15,20,23,24.
Neredeyse renk sapmalarından arınmış olan yüksek sayısal açıklık (NA), yansıtıcı tabanlı mikroskop objektiflerindeki (Schwarzschild ve Cassegrain geometrileri) ilerlemelerle, VSFG deneylerinde iki ışının odak boyutu 100 μm 2’den 1-2 μm2’ye ve bazı durumlarda mikron 25’in altına düşürülebilir. Bu teknolojik ilerlemeyi de içeren grubumuz ve diğerleri, VSFG’yi 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36 mikroskopi platformuna dönüştürdü. Son zamanlarda, çok modlu görüntülerin (VSFG, ikinci harmonik üretim (SHG) ve parlak alan optik) sorunsuz bir şekilde toplanmasını sağlayan ters çevrilmiş bir optik düzen ve geniş bant algılama şeması37 uyguladık. Çok modaliteli görüntüleme, optik görüntüleme kullanarak numunelerin hızlı bir şekilde incelenmesine, çeşitli görüntü türlerinin birbiriyle ilişkilendirilmesine ve numune görüntülerindeki sinyal konumlarının bulunmasına olanak tanır. Akromatik aydınlatma optikleri ve darbeli lazer aydınlatma kaynağı seçimi ile bu optik platform, diğerlerinin yanı sıra Floresan mikroskobu38 ve Raman mikroskobu gibi ek tekniklerin gelecekte sorunsuz entegrasyonuna olanak tanır.
Bu yeni düzenlemede, hiyerarşik organizasyonlar ve bir moleküler kendi kendine montaj sınıfı (MSA’lar) gibi örnekler incelenmiştir. Bu malzemeler, hem kimyasal bileşimin hem de geometrik organizasyonun malzemenin nihai işlevi için önemli olduğu kolajen ve biyomimetikleri içerir. VSFG ikinci dereceden doğrusal olmayan bir optik sinyal olduğundan, moleküller arası mesafe veya bükülme açıları gibi moleküller arası düzenlemelere39,40 özellikle duyarlıdır, bu da onu hem kimyasal bileşimleri hem de moleküler düzenlemeleri ortaya çıkarmak için ideal bir araç haline getirir. Bu çalışma, bir optik parametrik amplifikatörü (OPA) pompalayan iterbiyum katkılı boşluklu katı hal lazeri, ev yapımı çok modlu ters çevrilmiş mikroskop ve iki boyutlu yüklü birleştirilmiş cihaz (CCD) dedektörüne bağlı monokromatör frekans analizöründen oluşan çekirdek cihazın VSFG, SHG ve parlak alan modalitelerini açıklamaktadır27. Adım adım yapım ve hizalama prosedürleri ve kurulumun tam bir parça listesi sağlanır. Temel moleküler alt birimi, bir molekül sodyum-dodesil sülfat (SDS), ortak bir yüzey aktif madde ve iki molekül β-siklodekstrin (β-CD) içeren bir MSA’nın derinlemesine analizi, burada SDS@2 β-CD olarak bilinen, VSFG’nin organize maddenin moleküle özgü geometrik ayrıntılarını nasıl ortaya çıkarabileceğini göstermek için bir örnek olarak verilmiştir. MSA’nın kimyasala özgü geometrik detaylarının bir sinir ağı fonksiyon çözücü yaklaşımı ile belirlenebileceği de gösterilmiştir.
En kritik adımlar 1.42 ile 1.44 arasındadır. Optik uzamsal çözünürlük için objektif merceği iyi hizalamak çok önemlidir. Yayılan sinyalin toplanması, iletilmesi ve tarama ışınının giriş yarıklarında bir çizgi olarak yansıtılması da önemlidir. Doğru hizalamalar, en iyi çözünürlüğü ve sinyal-gürültü oranını garanti eder. SDS@2 β-CD 100 μm x 100 μm yaprak gibi tipik bir örnek için, yüksek sinyal-gürültü oranına sahip iyi çözünürlüklü bir görüntü (~1 μm çözünürl…
The authors have nothing to disclose.
Cihaz geliştirme, Grant NSF CHE-1828666 tarafından desteklenmektedir. ZW, JCW ve WX, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü, Hibe 1R35GM138092-01 tarafından desteklenmektedir. BY, Çin Bilimler Akademisi (CAS, 2021183) Gençlik İnovasyonu Teşvik Derneği tarafından desteklenmektedir.
1x Camera Por | Thorlabs | WFA4100 | connect a camera to a microscope or optical system |
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold | Thorlabs | MRA25-M01 | reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path |
3” Universal Post Holder-5 Pack | Thorlabs | UPH3-P5 | hold and support posts of various sizes and configurations |
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick | Thorlabs | LCP4S | convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system |
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm | Thorlabs | CEA1500 | provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy |
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris | Thorlabs | LCP50S | control the amount of light passing through an optical system |
60 mm Cage Mounting Bracket | Thorlabs | LCP01B | mount and position a 60 mm cage system in optical setups |
Air spaced Etalon | SLS Optics Ltd. | Customized | generate narrow-band 1030 nm light |
Cage Plate Mounting Bracket | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
CCD | Andor Technologies | Newton | 2D CCD for frequency and spatial resolution |
Collinear Optical Parametric Amplifier | Light Conversion | Orpheus-One-HP | Tunable MID light generator |
Copper Chloride | Thermo Fischer Scientific | A16064.30 | Self-assembly component |
Customized Dichroic Mirror | Newport | Customized | selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization |
Ext to M32 Int Adapter | Thorlabs | SM1A34 | provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types |
Infinity Corrected Refractive Objective | Zeiss | 420150-9900-000 | Refractive Objective |
Infinity Corrected Schwarzschild Objective | Pike Technologies Inc. | 891-0007 | Reflective objective |
Laser | Carbide, Light-Conversion | C18212 | Laser source |
M32x0.75 External to Internal RMS | Thorlabs | M32RMSS | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving | Thorlabs | M32M27S | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
Manual Mid-Height Condenser Focus Module | Thorlabs | ZFM1030 | adjust the focus of an optical element |
Monochromator | Andor Technologies | Shamrock 500i | Provides frequency resolution for each line scan |
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms | Thorlabs | ZFM2020 | control the vertical positon of the imaging objective |
Nanopositioner | Mad City Labs Inc. | MMP3 | 3D sample stage |
Resonant Scanner | EOPC | SC-25 | 325Hz resonant beam scanner |
RGB Color CCD Camera | Thorlabs | DCU224C | Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well |
RGB tube lens | Thorlabs | ITL200 | white light collection |
Right Angle Kinematic Breadboard | Thorlabs | OPX2400 | incorporate a sliding mechanism with two fixed positions |
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm | Thorlabs | KCB1 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage | Thorlabs | CSA2100 | securely mount and position condensers |
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long, | Thorlabs | C60L24 | enclose and protect the components inside the cage |
Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fischer Scientific | J63394.AK | Self-assembly component |
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages | Thorlabs | MCM3001 | control ZFM2020 |
Tube lens | Thorlabs | LA1380-AB – N-BK7 | SFG signal collection |
Visible LED Set | Thorlabs | WFA1010 | provide illumination in imaging setup |
Whitelight Source | Thorlabs | WFA1010 | Whitelight illumination source for brightfield imaging |
WPH05M-1030 – Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm | Thorlabs | WPH05M-1030 | alter the polarization state of light passing through it |
WPLQ05M-3500 – Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm | Thorlabs | WPLQ05M-3500 | alter the polarization state of light passing through it |
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages | Optosigma | TSD-65122CUU | positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction |
XT95 4in Rail Carrier | Thorlabs | XT95RC4 | mount and position optical components |
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation | Thorlabs | XYR1 | precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform |
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole | Thorlabs | XYT1 | provide precise movement and positioning in two dimensions |
Yb doped Solid State Laser | Light Conversion | CB3-40W | Seed laser |
β-Cyclodextrin | Thermo Fischer Scientific | J63161.22 | Self-assembly component |