रीढ़ की हड्डी उत्तेजना के दौरान मोटर न्यूरॉन्स में पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए रीढ़ की हड्डी के टुकड़े की पूर्व विवो तैयारी
Summary
यह प्रोटोकॉल उच्च स्थानिक संकल्प के साथ रीढ़ की हड्डी की उत्तेजना (एससीएस) के लिए मोटर न्यूरॉन्स की विद्युत प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए पैच-क्लैंप का उपयोग करके एक विधि का वर्णन करता है, जो शोधकर्ताओं को रीढ़ की हड्डी को अलग करने और सेल व्यवहार्यता को एक साथ बनाए रखने में अपने कौशल में सुधार करने में मदद कर सकता है।
Abstract
रीढ़ की हड्डी की उत्तेजना (एससीएस) रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) के बाद लोकोमोटर फ़ंक्शन को प्रभावी ढंग से बहाल कर सकती है। क्योंकि मोटर न्यूरॉन्स सेंसरिमोटर व्यवहार को निष्पादित करने के लिए अंतिम इकाई हैं, एससीएस के साथ मोटर न्यूरॉन्स की विद्युत प्रतिक्रियाओं का सीधे अध्ययन करने से हमें स्पाइनल मोटर मॉड्यूलेशन के अंतर्निहित तर्क को समझने में मदद मिल सकती है। एक साथ विविध उत्तेजना विशेषताओं और सेलुलर प्रतिक्रियाओं रिकॉर्ड करने के लिए, एक पैच-क्लैंप एकल-कोशिका पैमाने पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं का अध्ययन करने का एक अच्छा तरीका है। हालांकि, इस लक्ष्य को प्राप्त करने में अभी भी कुछ जटिल कठिनाइयां हैं, जिसमें सेल व्यवहार्यता बनाए रखना, रीढ़ की हड्डी को हड्डी की संरचना से जल्दी से अलग करना और कार्रवाई क्षमता को सफलतापूर्वक प्रेरित करने के लिए एससीएस का उपयोग करना शामिल है। यहां, हम उच्च स्थानिक संकल्प के साथ एससीएस को मोटर न्यूरॉन्स की विद्युत प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए पैच-क्लैंप का उपयोग करके एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो शोधकर्ता को रीढ़ की हड्डी को अलग करने और एक ही समय में सेल व्यवहार्यता बनाए रखने में अपने कौशल में सुधार करने में मदद कर सकता है ताकि मोटर न्यूरॉन पर एससीएस के विद्युत तंत्र का सुचारू रूप से अध्ययन किया जा सके और अनावश्यक परीक्षण और गलती से बचा जा सके।
Introduction
रीढ़ की हड्डी की उत्तेजना (एससीएस) रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) के बाद लोकोमोटर फ़ंक्शन को प्रभावी ढंग से बहाल कर सकती है। एंड्रियास Rowald एट अल बताया कि SCS एक ही दिन के भीतर निचले अंग लोकोमोटर और ट्रंक समारोह सक्षम बनाताहै 1. लोकोमोटर रिकवरी के लिए SCS के जैविक तंत्र की खोज करना एक अधिक सटीक SCS रणनीति विकसित करने के लिए एक महत्वपूर्ण और ट्रेंडिंग अनुसंधान क्षेत्र है। उदाहरण के लिए, ग्रेगोइरे कोर्टिन की टीम ने प्रदर्शित किया कि रीढ़ की हड्डी में उत्तेजक Vsx2 इंटरन्यूरॉन और Hoxa10 न्यूरॉन्स SCS की प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण न्यूरॉन्स हैं, और एससीआई2 के बाद चूहे के चलने की क्षमता को बहाल करने के लिए सेल-विशिष्ट न्यूरोमॉड्यूलेशन संभव है। हालांकि, कुछ अध्ययन एकल-कोशिका पैमाने पर एससीएस के विद्युत तंत्र पर ध्यान केंद्रित करते हैं। हालांकि यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि सुपरथ्रेशोल्ड प्रत्यक्ष वर्तमान उत्तेजना क्लासिक स्क्वीड प्रयोग 3,4,5 में एक्शन पोटेंशिअल (एपी) को कैसे प्राप्त कर सकती है, एससीएस जैसे स्पंदित वैकल्पिक विद्युत उत्तेजना, मोटर सिग्नल पीढ़ी को कैसे प्रभावित करती है, अभी भी स्पष्ट नहीं है।
इंट्रास्पाइनल तंत्रिका सर्किट की जटिलता को देखते हुए, एससीएस के विद्युत तंत्र की जांच के लिए सेल आबादी के लिए उपयुक्त चयन महत्वपूर्ण है। हालांकि SCS प्रोप्रियोसेप्टिव पाथवे6 को सक्रिय करके मोटर फ़ंक्शन को पुनर्स्थापित करता है, मोटर न्यूरॉन्स मोटर कमांड को निष्पादित करने के लिए अंतिम इकाई है, जो प्रोप्रियोसेप्शन सूचना अभिवाही इनपुट7 को एकीकृत करने से प्राप्त होता है। इसलिए, एससीएस के साथ मोटर न्यूरॉन्स की विद्युत विशेषताओं का सीधे अध्ययन करने से हमें स्पाइनल मोटर मॉड्यूलेशन के अंतर्निहित तर्क को समझने में मदद मिल सकती है।
जैसा कि हम जानते हैं, पैच-क्लैंप अत्यंत उच्च spatiotemporal संकल्प8 के साथ सेलुलर electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए सुनहरा मानक विधि है. इसलिए, यह अध्ययन एससीएस को मोटर न्यूरॉन्स की विद्युत प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए पैच क्लैंप का उपयोग करके एक विधि का वर्णन करता है। मस्तिष्क पैच-क्लैंप9 की तुलना में, रीढ़ की हड्डी पैच-क्लैंप निम्नलिखित कारणों से अधिक कठिन है: (1) रीढ़ की हड्डी को कशेरुक नहर द्वारा छोटी मात्रा के साथ संरक्षित किया जाता है, जिसके लिए बेहतर सेल व्यवहार्यता प्राप्त करने के लिए बहुत ठीक माइक्रोमैनिपुलेशन और कठोर बर्फ-ठंडा रखरखाव की आवश्यकता होती है। (2) क्योंकि रीढ़ की हड्डी काटने की ट्रे पर सुरक्षित होने के लिए बहुत पतली है, इसे कम पिघलने बिंदु अगारोज़ में डुबोया जाना चाहिए और जमने के बाद छंटनी चाहिए।
इसलिए, यह विधि रीढ़ की हड्डी को विदारक करने और एक ही समय में सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने में तकनीकी विवरण प्रदान करती है ताकि मोटर न्यूरॉन्स पर एससीएस के विद्युत तंत्र का सुचारू रूप से अध्ययन किया जा सके और अनावश्यक परीक्षणों और गलतियों से बचा जा सके।
Protocol
Representative Results
Discussion
SCS द्वारा संग्राहक आंदोलन की जानकारी अंत में मोटर न्यूरॉन्स के लिए परिवर्तित है. इसलिए, अनुसंधान लक्ष्य के रूप में मोटर न्यूरॉन्स लेने से अध्ययन डिजाइन सरल हो सकता है और एससीएस के न्यूरोमॉड्यूलेशन तंत?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना फॉर यंग स्कॉलर्स (52207254 और 82301657) और चाइना पोस्टडॉक्टोरल साइंस फंड (2022M711833) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
Referências
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
- Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
- Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
- Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
- Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
- Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
- Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
- Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
- Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
- Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
- Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
- Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
- Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
- Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
- Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
- Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
- Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
- Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
- Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
- Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
- Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).
