מדידת צריכת O₂ בדרוזופילה מלנוגסטר באמצעות מיקרו-רספירומטריה קולומטרית

היכולת למדוד קצב חילוף חומרים חיונית להבנה מלאה של אורגניזם בהקשר הסביבתי שלו. לדוגמה, יש צורך למדוד את קצב חילוף החומרים כדי להבין את תפקידו בתוחלת החיים¹, את תפקיד הדיאטה בחילוף החומרים², או את הסף ללחץ היפוקסי³.

ישנן שתי גישות כלליות למדידת קצב חילוף החומרים⁴. קלורימטריה ישירה מודדת את הוצאת האנרגיה ישירות על ידי מדידת ייצור חום. קלורימטריה עקיפה מודדת את ייצור האנרגיה באמצעים אחרים, לעתים קרובות באמצעות מדידה ספירומטרית של צריכת O 2 (V_O2), ייצור CO₂ או שניהם. למרות שקלורימטריה ישירה יושמה על אקטורמות קטנות, כולל Drosophila melanogaster⁵, רספירומטריה היא פשוטה יותר מבחינה טכנית ונפוצה יותר.

מספר צורות של רספירומטריה שימשו בהצלחה למדידת קצב חילוף החומרים בטבע ובמוטציה D. melanogaster וסיפקו תובנה לגבי ההשפעות המטבוליות של טמפרטורה⁶, סביבה חברתית 3, תזונה ^{3,7 והפרעות} נוירו-התפתחותיות⁸. אלה נופלים לשני סוגים, אשר משתנים במידה ניכרת בעלות ובמורכבות. מנומטריה היא^ה-9,10 הפשוטה והזולה ביותר^, שבה הזבובים מוכנסים לתא אטום המכיל סופג_CO2 ומחובר באמצעות נימים דקים למאגר נוזלים. כאשר O 2 נצרך ו- CO₂ נספג, הלחץ בחדר יורד ונוזל נשאב לתוך הנימים. הנפח המלא בנוזל של הנימים הוא אפוא פרופורציונלי ל- V_O2. גרסאות משוכללות יותר, המפצות על הכוח המופעל על ידי הנוזל בנימים, שימשו גם על D. melanogaster¹. למנומטריה יש את היתרונות של היותה פשוטה וזולה, אך מכיוון שהיא רגישה ללחץ, דורשת תנאי סביבה קבועים. יתר על כן, מכיוון שנצרך O 2 אינו מוחלף, הלחץ החלקי של O₂ (P_O2) יורד בהדרגה בתוך החדרים.

רספירומטריה באמצעות ניתוח גז משמשת באופן קבוע גם עבור D. melanogaster. במקרה זה, גזים נדגמים במרווחי זמן קבועים מחדרים אטומים המכילים זבובים ונשלחים לאנלייזר אינפרא אדום ^2,6,11. לסוג זה של מכשיר יש את היתרונות שהוא זמין מסחרית, הוא פחות רגיש לתנאי הסביבה, וגזים מתחדשים במהלך הדגימה כך ש- P_O2 נשאר יציב. עם זאת, הציוד יכול להיות יקר ומורכב לתפעול.

מיקרו-רספירומטר^{קולומטרי 12} שפותח לאחרונה מספק חלופה זולה, רגישה ויציבה למערכות קיימות. בפועל, אורגניזם ממוקם לתוך תא אטום שבו הוא צורך O 2 ואת CO₂ נשוף מוסר על ידי חומר סופג, וכתוצאה מכך ירידה נטו בלחץ החדר. כאשר הלחץ הפנימי יורד לסף מוגדר מראש (ON-threshold), הזרם מועבר דרך מחולל אלקטרוליטי O₂, ומחזיר את הלחץ לסף שני (OFF-threshold) העוצר אלקטרוליזה. העברת מטען על פני מחולל O 2 עומדת ביחס ישר לכמות O 2 הנדרשת ללחץ מחדש על התא ולכן ניתן להשתמש בה כדי למדוד את O₂ הנצרך על ידי האורגניזם⁴. השיטה רגישה מאוד, מודדת V O2 במדויק, וההחלפה הקבועה של O₂ יכולה לשמור על P_O2 ברמה כמעט קבועה במשך שעות או ימים.

המיקרו-רספירומטר הקולומטרי המשמש במחקר זה משתמש בחיישן אלקטרוני רב-מודאלי (לחץ, טמפרטורה ולחות). החיישן מופעל על ידי מיקרו-בקר המזהה שינויים קטנים בלחץ ומפעיל דור_{O 2} כאשר מגיעים לסף לחץ נמוך¹². מכשיר זה מורכב מחלקי המדף, ניתן להשתמש בו עם מגוון רחב של תאים וסביבות ניסוי, ושימש בהצלחה לבחינת ההשפעות של מסת הגוף והטמפרטורה על החיפושית Tenebrio molitor. במחקר הנוכחי, המיקרו-רספירומטר הותאם למדידת צריכת O₂ ב- D. melanogaster, שיש לו כ -1% מהמסה של T. molitor. רגישות המנגנון הוגברה על ידי הפחתת הסף להפעלת דור_{O 2} , והיציבות הסביבתית שופרה על ידי ביצוע ניסויים באמבט מים מבוקר טמפרטורה ועל ידי שמירה על לחות בתוך התאים ברמה של 100% או קרוב לכך.

חלבון CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), חלק ממשפחת הקינאזות הגואנילטות הקשורות לקרום (MAGUK), הוא פיגום מולקולרי בקומפלקסים רב-חלבוניים שונים, ומוטציות ב-CASK קשורות להפרעות נוירו-התפתחותיות בבני אדם וב-D. melanogaster^13,14. מוטציה בת קיימא של D. melanogaster, CASK^Δ18, משבשת את הפעילות של נוירונים דופמינרגיים 15 ומפחיתה את רמות הפעילות ביותר מ-50% בהשוואה לבקרות קונגניות^14,16. בגלל רמות הפעילות הנמוכות יותר של מוטציות CASK ותפקידם של קטכולאמינים בוויסות חילוף החומרים¹⁷ שיערנו שקצב חילוף החומרים הסטנדרטי שלהם, ולכן צריכת O₂, יופחתו באופן דרמטי בהשוואה לבקרות.

צריכת O₂ נמדדה ב-CASK^Δ18 ובקונגנרים הפראיים שלהם, w(ex33). קבוצות של זבובים הוכנסו לתאי רספירומטריה, צריכת O 2 נמדדה, צריכת O₂ חושבה והתבטאה הן על בסיס מסה ספציפית והן על בסיס זבוב. המנגנון תיעד V_O2 בזבובי בר שהיה עקבי עם מחקרים קודמים, והוא יכול היה להבדיל בין צריכת O₂ לכל זבוב של זבובי בר לבין צריכת מוטציות CASK לכל זבוב.