全安装荧光 原 位杂交研究 按 蚊精子发生

在这项工作中，WFISH用于研究 冈比亚安斯精子发生过程中的染色体行为。应用该方案的第一个关键步骤是获得解剖后显示低水平形态学改变的睾丸。成功进行睾丸解剖需要了解蚊子解剖学的基本知识，下面给出了该程序的一些指导。在 按蚊 中，成熟的睾丸位于蛹和成虫阶段的第六腹节21。 如图 1 所示， 输精管 将睾丸连接到位于腹部最后一节的男性副腺 （MAG）。MAG连接到一个独特的射精管，该射精管将精子和输送到交配器官和男性生殖器器官的外部21。根据蚊子的生命阶段，可以使用不同的方法解剖整个男性内部生殖器。在蛹期，通过观察第六节附近的腹部腹侧，可以使用立体显微镜在整个浅角质层中轻松识别睾丸（图1）。为了解剖睾丸，可以使用一对针将腹部下部（包括第六节）与身体其他部位隔离，并转移到干净的1x PBS滴中。在移除最后一节后，可以通过用解剖针轻轻施加压力将整个装置从腹部挤压出来。为了从成年男性身上解剖睾丸，第一步是在新鲜的1x PBS滴中分离整个腹部，然后拉出带有扣环的最后一段，这是雄配结构（图1）。此时，MAG的下部应该会出现，并且由于它们的黄色而易于识别。然后，可以在针头或镊子的帮助下在1x PBS滴中缓慢拉出整个男性装置，直到可以看到附着在 输精管 上的一对睾丸。在进行固定之前，重要的是通过在 输精管 下部附近切割睾丸与男性器官的其他部分隔离（图1）。 蛹或成年雄性的年龄是要考虑的重要因素，具体取决于所研究的精子发生阶段。在 冈比亚安 蛹中，精子发生始于蛹早期/中期，并贯穿个体的整个生命24.化蛹后3 h至10 h之间，减数分裂前期和减数分裂阶段在睾丸中更明显（减数分裂前期、减数分裂），精子细胞DNA相对未浓缩，尚未形成成熟精子。晚期蛹和1日龄成虫在减数分裂前期、减数分裂和减数分裂后阶段之间提供了良好的平衡（图2 和 图3）。在超过4天的成年人中，减数分裂前期和精子囊的代表性较少，睾丸主要被精子库中包含的成熟精子占据。 为了研究性染色体在精子发生的不同阶段的行为，对在蛹后期解剖的睾丸进行了WFISH，以确保整个过程的良好表现。为了跟踪这些染色体的行为，使用了专门位于X或Y染色体上的重复序列特异性荧光探针。荧光探针可以使用PCR生成，也可以作为3’末端标记的寡核苷酸在商业上获得。建议使用长度为 >40 bps 的寡核苷酸，以便从荧光寡核苷酸探针进行良好的信号检测。根据我们的经验，3’末端标记的寡核苷酸在信号检测方面优于PCR标记的探针。此外，靶序列的拷贝数是可能影响WFISH疗效的一个因素。如果标记不成功，建议在较长的片段上使用PCR标记方法或设计针对靶区域的几种寡核苷酸。 目前的方法基于使用渗透溶液（1% Triton/0.1 M HCl 在 1x PBST 中的溶液），允许良好的睾丸透化和探针渗透水平，从而实现成功的杂交反应。特异性性染色体重复序列的寡核苷酸探针可以基于 Hall 等人对重复元件的广泛表征进行设计20。此外，可以使用生物信息学平台（如RedKmer管道30）获得特定于X或Y连接重复元件的共识序列。需要注意的是，性染色体探针可以靶向重复元件，如卫星和逆转录转座子，并且它们可以与X或Y染色体具有不同水平的杂交，具体取决于所检查的物种20,31,32。如图 3 所示，探针的良好杂交水平和低背景允许在整个精子发生过程中可视化靶向染色体。标记性染色体的配对可以在减数分裂前期和减数分裂阶段看到。随后检测减数分裂产生的单倍体细胞核染色体中的 X 或 Y 染色体。随后，携带X或Y的精子细胞可以在整个精子发生过程中进行跟踪，其特征是不同程度的DNA凝聚，直到箭形成熟精子的最后一步。在本实验装置中，共聚焦Z-stacks用于在此过程中获取有关细胞3D空间组织的信息（视频1）。 图1：从蛹和1日龄成年冈比亚按蚊雄性解剖的睾丸。 （A） 在蛹后期解剖的腹部，显示睾丸在第六腹节附近的位置。睾丸可以在整个角质层中识别，并在腹部两侧显示为褐色结构（带箭头）。（B） 在蛹期解剖睾丸，显示成熟睾丸 （1）、输精管 （2）、MAG （3） 和射精管 （4）。（C） 从一名 1 日龄成年男性身上解剖的腹部，该腹部在移除基扣段后。MAG可以通过施加轻微的压力（白色箭头）从腹部挤压。（D） 从一名 1 日龄的成年男性身上解剖的男性内生殖器。白色箭头表示成熟精子所占据的位置，精子在睾丸的基极处表现为白色聚集体。比例尺：（A，C）200μm;（B，D）100μm。从I到VIII的罗马数字表示腹部节段。请点击这里查看此图的较大版本. 图2：冈比亚按蚊中精子发生的表现。左图显示了整个DAPI染色后的冈比亚蛹晚期睾丸。右边是示意图版本，以便更好地可视化。通过观察细胞核的形状和凝聚水平，相对容易地跟踪从二倍体细胞到单倍体精子的所有精子发生阶段。干细胞生态位位于器官的上极，从那里开始分化为精原细胞。有丝分裂后精原细胞数量增加（绿色细胞），精子囊大小增加（黄色细胞）。精原细胞在多轮有丝分裂后分化为精母细胞（蓝细胞）。精母细胞的特征在于细胞核比该过程其他阶段的细胞相对大，是将经历减数分裂的细胞。经历减数分裂的细胞可以通过观察不同减数分裂阶段染色体的存在来检测;即使在低倍率下也可以检测到交叉和中期染色体。减数分裂前期在早期蛹期解剖的睾丸中比例过高。在第一次和第二次减数分裂之后，产生精子细胞，通常可以发现位于睾丸中间。精子细胞的细胞核在形状上显示出一定程度的变化，从圆形到箭头状。精子细胞进入精子发生过程，在此期间细胞核开始凝结，其结构变为箭头状的点。当蚊子出现后性成熟时，含有成熟精子的精囊可以占据大部分睾丸体积，而牺牲处于不同发育阶段的精子囊。比例尺：20μm。星号（*）表示睾丸的顶端部分。请点击这里查看此图的较大版本. 图3：从蛹后期解剖的冈比亚An.gambiae睾丸上的WFISH。 使用对 X （Contig_240） 和 Y（AgY53B 具有特异性的寡核苷酸探针）染色体特异性探针进行 WFISH。（A） WFISH允许跟踪从二倍体细胞到单倍体精子的精子发生过程中性染色体的行为。在这张图片中，可以欣赏到细胞核在精子发生过程中所经历的巨大变化。标记性染色体可以区分二倍体和单倍体细胞。在二倍体细胞中，来自性染色体的信号与相同的细胞核相连。在单倍体细胞（精子细胞和精子）中，由于减数分裂的减少分裂，性染色体的信号是无连接的。（乙，丙）（A）所示的睾丸的较高放大倍率（63倍）图像。它们是在沿 Z 轴的不同位置采集的。白色虚线框表示采集区域。（B）精母细胞和精子细胞之间的过渡阶段，显示单倍体细胞的形成以及性染色体信号分离成单独的细胞核。（C）单倍体精子细胞和成熟精子之间的过渡阶段。该阶段显示了核凝结水平的变化;成熟的精子比精子显示出更浓缩和细长的形状。比例尺：（A），30 μm;（B，C），10μm;灰色：DAPI。请点击这里查看此图的较大版本. 靶序列 引物序列和寡核苷酸探针一致性 参考 Contig_240 （X） 5′-CAATAAATTTCCTTTTTAATGATGCAAAATCTACGTCTCTAGC-3′-[荧光染料] 19 银钎53B （Y） 5’AGAAGAATAGAATCAGAATAGTCGGTTTCTTCATCCTGAAAGCC-3′-[荧光染料] 本研究 银477-银钎53B结区域 （Y） 5′-TTCTAAGTTTCTAGGCTTTAAGGATGAAGAAACCGACTATTC-3′-[荧光染料] 19 18S rDNA （X） 女：AACTGTGGAAAAGCCAGAGCR：TCCACTTGATCCTTGCAAAA 19 银钎53B （Y） 传真： CCTTTAAACACATGCTCAAATTR：GTTTCTTCATCCTTAAAGCCTAG 19 表 1： 冈比亚 An. gambiae 中 X 或 Y 染色体特异性寡核苷酸探针列表。 视频1：在WFISH上对从蛹后期解剖的 冈比亚An.gambiae 睾丸进行3D堆栈。 为了获得精子发生过程的 3D 表示，可以在显示少量结构改变的睾丸上进行共聚焦 3D 堆栈。在这项研究中，在63倍或40倍油透镜下，在两个光学截片之间以1.25μm的间隔进行堆叠，以免丢失有关细胞3D空间组织的信息。灰色：DAPI，黄色：Contig_240（X），品红色：AgY53B（Y）。 请按此下载此影片。