الكشف المتزامن عن فئات مختلفة من الأجسام المضادة في اختبار مصلي متعدد الإرسال
Summary
تم استخدام نظام تحليل تدفق مضان مزدوج القناة ثلاثي القنوات لتطوير مقايسة مناعية متعددة القائمة على الخرز تقوم في نفس الوقت بتقييم عينات المصل ل IgG و IgM المستنبطة ضد مستضدات متعددة من أنواع بوريليا المختلفة التي تسبب داء لايم في أوروبا وأمريكا الشمالية.
Abstract
لمراقبة تطور الأمراض المعدية ، من المفيد تقييم النشاط المناعي مقابل محددات المستضدات المختلفة ، وقياس الأنماط المتماثلة المختلفة للأجسام المضادة لأنها تظهر في مراحل مختلفة من الاستجابة المناعية للمضيف. مع داء لايم ، يمكن أن يكون العامل الممرض أحد الأعضاء المتعددين في أنواع بوريليا . لذلك ، يتطلب التصنيف الصحيح للعينة تقييم النشاط المناعي ضد المستضدات المختلفة لأنواع Borrelia المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون لاستجابات IgG و IgM المضادة للأمراض دورات زمنية مختلفة للاستنباط أثناء تطور المرض. نوضح هنا تطوير مقايسة مناعية متعددة الإرسال من مراسلين لها فائدة في تحديد الاستجابة المناعية الخاصة بالبوريليا في عينات المصل البشري من خلال تقييم كل من النشاط المناعي IgG و IgM في وقت واحد ضد المستضدات البكتيرية المختلفة في نفس التفاعل جيدا. يحتفظ نهج المراسل المزدوج هذا بالأداء التحليلي لأساليب المراسل الفردي مع الحفاظ على الوقت والموارد وتقليل متطلبات حجم العينة. يسمح هذا الفحص بشكل أساسي بمضاعفة المعلومات المصلية التي يتم إنشاؤها من عينة الدم في نصف الوقت.
Introduction
داء لايم هو أكثر الأمراض المعدية المنقولة بالقراد شيوعا في المناخات المعتدلة في نصف الكرة الشمالي1. وهو ناتج عن بكتيريا spirochete من جنس Borrelia ، مع خمسة مسببات الأمراض البشرية المعروفة التي تختلف في التوزيع الجغرافي2. أنواع بوريليا المسببة للأمراض الرئيسية في أوروبا هي B. afzelii و B. garinii ، مع B. burgdorferi s.s. و B. spielmanii و B. bavariensis متورطة بشكل أقل. في أمريكا الشمالية ، B. burgdorferi s.s. هو العامل المسبب الوحيد لمرض لايم2،3. تنتقل مسببات الأمراض Borrelia من قبل أعضاء جنس القراد Ixodes ، مع انتقال يمكن أن يحدث في غضون 24 ساعة من لدغة القراد4.
عادة ما يتم تشخيص داء لايم من خلال الأعراض السريرية ويتم تأكيده لاحقا بواسطة الأمصال. في كل من أوروبا وأمريكا الشمالية ، توصي الإرشادات التشخيصية بسلسلة اختبار من خطوتين تتكون من مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) مع لطخة مناعية منعكسة لتقييم استجابة الأجسام المضادة ضد مستضدات بوريليا المحددة1،5،6،7،8،9. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يفتقر إلى الحساسية وهو دون المستوى الأمثل ، لا سيما في المرحلة المبكرة من العدوى عندما يكون التحويل المصلي غير مكتمل ويكون عيار Borrelia IgG و IgM منخفضا جدا6.
تعمل المقايسات المناعية المتعددة على تحسين المقايسات المناعية التقليدية التي تقيس هدفا واحدا فقط في كل مرة ، ويمكنها في وقت واحد تقييم استجابات النمط المتماثل للأجسام المضادة المتعددة مقابل واحد أو أكثر من المستضدات10،11،12. تقتصر المقايسات مثل ELISAs على تحديد وقياس مادة تحليلية واحدة لكل تفاعل ، في الحالة الحالية إما تعميم IgG أو IgM المستحث ضد مستضد بكتيري واحد بعد الإصابة بالبوريليا. يوضح هذا التقرير استخدام تقنية التنميط التحليلي القائمة على الخرز لتطوير مقايسة مناعية متعددة الإرسال تكتشف في نفس الوقت كلا من الأجسام المضادة IgG و IgM ضد أي من مستضدات Borrelia المختارة هنا في عينات المصل البشري. اخترنا أربعة مستضدات تغطي معا أكثر أنواع بوريليا المسببة للأمراض شيوعا في أوروبا (B. غاريني ، ب. أفزيلي ، ب. بورغدورفيري س.) وأمريكا الشمالية (B. burgdorferi s.s.) (الجدول 1) 2,3. وهذا يسمح بتحديد مسببات الأمراض بشكل حاسم والقدرة على تمييز النشاط المناعي المبكر IgM ولاحقا الأكثر متانة في عينات المرضى.
| النمط المتماثل المستهدف | قناة المراسل | مستضد | أنواع بوريليا | وتر | تركيز اقتران المستضد |
| الغلوبولين | بى | أوسب سي | ب. غاريني | 20047 | 5.0 ميكروغرام / 106 حبات |
| IgG | BV421 | VlsE | ب. بورغدورفيري س. س | ب 31 | 1.25 ميكروغرام / 106 حبات |
| IgG | BV421 | دببا | ب. بورغدورفيري س. س. | ZS7 | 10.0 ميكروغرام / 106 حبات |
| IgG | BV421 | دببا | ب. أفزيلي | بكو | 5.0 ميكروغرام / 106 حبات |
الجدول 1: مستضدات بوريليا التمثيلية المستخدمة لتطوير مقايسة تعدد الإرسال.
قمنا في البداية بتطوير مقايسة مناعية أحادية البلاغات اكتشفت إما الأجسام المضادة لمستضد بوريليا IgG أو IgM في تفاعلين منفصلين ثم دمجنا هذه المقايسات في مقايسة متعددة الإرسال مزدوجة المراسل تقيس كلا النمطين المتماثلين للأجسام المضادة في نفس خليط التفاعل. تقترن الخرزات المغناطيسية بمستضد مستهدف ممرض مهم ، ثم يتم تحضينها بعينات مصل المريض. يتعرف المستضد المقترن بالخرزة على كل من IgG و IgM المنتشرين في المصل الذي يتم إنشاؤه في استجابة مناعية ضد مستضد مسببات الأمراض. يتم تحديد خصوصية الفحص IgG مقابل IgM من خلال اختيار جسم مضاد ثانوي يرتبط إما ب IgG أو IgM ، ولكل منهما إشارة فلوروفور مميزة مرتبطة بالجسمين المضادين الثانويين. يتم الكشف عن كل إشارة فلورية في إحدى قناتي Reporter للأداة (أي المراسل المزدوج) التي تحتوي على ليزر إثارة مختلف والتقاط انبعاث خاص بالفلوروفور الفردي المستخدم للكشف إما IgG أو IgM (هنا Brilliant Violet 421 أو phycoerythrin ، على التوالي). تحدد قناة تصنيف الأداة الصبغة المرمزة بالألوان المتأصلة في مجموعات الخرز المختلفة. وبالتالي ، يمكن إقران المستضدات المستهدفة المتعددة بخرز مصبوغ بشكل مختلف ، ويتم خلط مجموعات الخرزات معا واستخدامها لإجراء تقييم شامل للتفاعل المناعي المتنوع المضاد لمسببات الأمراض في عينات المصل. تحدد قناة التصنيف كل مجموعة خرزة فردية (أي مستضد محدد) وتقيس التألق المرتبط ب IgG أو IgM مقابل هذا المستضد. يوفر الفحص المتعدد الناتج الوقت والموارد مقابل الاختبار الكلاسيكي الأقل شمولا ويفهرس بدقة التفاعل المناعي لايم في أحجام عينات محدودة. في حين تم استخدام نهج مماثل للمراسل المزدوج سابقا لتصنيف الاستجابات المناعية في أمراض أخرى مثل عدوى SARS-CoV-213 ، يفصل هذا التقرير تطبيق تقنية مقايسة الفلورسنت المتعدد لتوصيف النشاط المناعي في داء لايم.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسلط هذا التقرير الضوء على تطوير اختبار منافي Borrelia قائم على الخرز ثنائي التقارير والذي يحدد بشكل متكرر وحساس النشاط المناعي المضاد للبوريليا في عينات المصل12. يمكن التمييز بين أنواع Borrelia المسببة للأمراض المختلفة التي تسبب مرض لايم عن طريق عدم تجانس المستضد الخاص بالمتغيرات6،7،8،9. يقوم الفحص متعدد الإرسال بشكل متزامن بتقييم النشاط المناعي المضاد للبوريليا بوساطة IgG و IgM داخل نفس بئر التفاعل ، وبالتالي الحفاظ على الكواشف والعمالة ومواد العينة اللازمة لإجراء مقايستين مفردتين بشكل منفصل. قد تسمح مقارنة استجابات IgM و IgG بمرور الوقت بتتبع أفضل لتطور المرض حيث يحدث التحويل المصلي من IgM إلى IgG بعد الإصابة6.
يستخدم نظام المراسل المزدوج نظامين مختلفين للكشف عن الأجسامالمضادة 13,15. أظهرت التجارب ذات الصلة عدم وجود تفاعل متقاطع كبير يمكن اكتشافه بين أنظمة الكشف عن Borrelia anti-IgM و Anti-IgG عندما تم تحليل فئتي الأجسام المضادة معا في نفس بئرالتفاعل 12. بالنظر إلى تقارب الارتباط المنخفض للأجسام المضادة IgM مقابل IgG16,17 ، اخترنا جسما مضادا للكشف عن PE مترافقا للكشف عن IgM (أول قناة مراسل لأداة المراسل المزدوج) لأن PE هي واحدة من أقوى الفلوروفورات الباعثة المستخدمة بشكل روتيني في المقايسات المناعية18. لتقييم IgG ، استخدمنا جسما مضادا للكشف عن البيوتينيلات تم إضاءته لاحقا باستخدام الستربتافيدين المترافق BV421 (قناة المراسل الثانية للأداة)19. على الرغم من خطوة الحضانة الإضافية البالغة 30 دقيقة مقارنة بنظام المراسل الواحد ، فإن نظام المراسل المزدوج ينتج ضعف المعلومات لكل تفاعل. بشكل عام ، يتطلب الفحص المتعدد الإرسال للتقرير المزدوج وقتا تراكميا ومدخلات مادية أقل من تشغيل مقايستين لتقرير واحد.
تم تجسيد الأداء القوي والاستقرار لمقايسة Borrelia متعددة الإرسال من خلال قابلية عالية للتكرار في دراسات الدقة داخل وبين المقايسة ، ومن خلال إظهار خطية التخفيف وتوازي التخفيف على نطاق واسع من تركيزات العينة لكل من تقييم IgG و IgM. لاحظنا مستويات انبعاث مضان مطلقة أعلى لنفس الفلوروفورات باستخدام أداة أحادية القناة مقابل نظام ثنائي القناة (≈1.7× أعلى مع PE) ، ويعزى ذلك إلى الاختلافات في البصريات وإعدادات المعايرة بين الجهازين (الشكل 4). ومع ذلك ، ظلت منحنيات انبعاث التألق مع كلا الفلوروفورين ضمن النطاق الخطي لكلا الجهازين عند أقصى درجات تخفيف العينة العالية والمنخفضة ، ولم يؤثر أي تباين في التألق المطلق المقاس على تصنيف حالة التعرض لبوريليا . 12
تتمثل الميزة الرئيسية لمقايسة Borrelia multiplex القائمة على الخرزة في السهولة التي يمكن بها تعديل الفحص أو توسيعه لتقييم التحليلات المختلفة أو الإضافية ، على سبيل المثال ، للكشف عن الأجسام المضادة ضد مستضدات أنواع Borrelia الأخرى. تحتوي مجموعات الخرزات المغناطيسية xMAP على مجموعات صبغ مختلفة يمكن تمييزها في قناة تصنيف الأداة ويمكن تنفيذها نظريا في مقايسات متعددة يمكنها تقييم ما يصل إلى 500 تحليل فريد في نفس الوقت داخل نفس العينة. بينما تسلط الدراسة الحالية الضوء على أربعة مستضدات بوريليا تمثيلية لإثبات وظيفة الفحص واستقراره ومقارنة نظام المراسل الفردي والمزدوج ، يستجوب الفحص النهائي ثمانية مستضدات يمكنها معا تحديد جميع مسببات الأمراض الخمسة ذات الصلة سريريا المنتشرة في جميع أنحاء أوروبا وأمريكا الشمالية12.
يمكن الحصول على أداء عالي الإنتاجية باستخدام لوحات معايرة دقيقة قياسية ذات 384 بئرا بتنسيق فحص شبه آلي. يسمح توافق الفحص والأداة مع كل من لوحات 96 و 384 بئرا باستخدام مقايسة Borrelia multiplex كأداة فحص فعالة لتحليل مجموعات العينات الكبيرة بسرعة ، مثل الدراسات الوطنية20. يظل الأداء اليدوي للفحص ممكنا لمجموعات العينات الأصغر باستخدام لوحات أصغر من 96 بئرا.
تشمل قيود الدراسة التقييم المقارن لعدد قليل فقط من أهداف النشاط المناعي Borrelia في عدد صغير من عينات المصل البشري. ومع ذلك ، أكدت الدراسة الأصلية أنه تم الحفاظ على أداء الفحص لكل من IgG و IgM عند تحليل ثمانية مستضدات من جميع أنواع Borrelia الخمسة المعروفة ضمن مجموعة عينات أكبر12. أيضا ، يمكن لأداة المراسل المزدوج تقييم نمطين متماثلين من الأجسام المضادة فقط في وقت واحد داخل كل تفاعل ، لذا فإن التنميط الكامل للنمط المتماثل سيتطلب إجراء تفاعلات فحص إضافية13.
في الختام ، يفصل هذا التقرير الاندماج الناجح وتحويل المقايسات المناعية أحادية المراسل القائمة على الخرز إلى مقايسات مزدوجة المراسل يمكنها في نفس الوقت تقييم الأجسام المضادة IgG و IgM الخاصة ببوريليا في عينات المصل البشري. يوفر هذا النهج المشترك إجمالي الوقت والمواد ومدخلات العمل لتوليد نفس حجم البيانات مثل مقايستين مستقلتين لتقرير واحد. يمكن توسيع نطاق الفحص المتعدد من 96 بئرا إلى تنسيق لوحة معايرة دقيقة 384 بئرا ويمكن أن يكون شبه آلي باستخدام الألواح الآلية وأجهزة معالجة السوائل ، مما يجعله مناسبا للتطبيقات عالية الإنتاجية مثل المسوحات السكانية الكبيرة. أثبتت أنظمة الفحص المزدوج القائمة على الخرز سابقا فائدتها في تقييم ، على سبيل المثال ، الاستجابات المناعية لمسببات الأمراض الفيروسية والبكتيرية الأخرى13،21 ، وتقييم استجابات الأجسام المضادة الخيفية ضد حوامل HLA في زرع الأعضاء22 ، واستكشاف آليات أمراض المناعة الذاتية23. فصل التقرير الحالي استخدام تقنية تعدد الإرسال لتحديد التعرض لمسببات الأمراض Borrelia التي تسبب مرض لايم ، كمثال على كيفية قيام المختبرات بتكييف هذا النهج لاستكشاف آليات المناعة المعقدة في أمراض متنوعة.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا التقرير من قبل Luminex (أوستن ، تكساس). يشكر المؤلفون ماثيو سيلفرمان دكتوراه (حلول النشر الطبية الحيوية ، مدينة بنما ، فلوريدا ؛ mattsilver@yahoo.com) للمساعدة في التحرير التحليلي والعلمي. يشكر المؤلفون أيضا هارالد كلاين وكريستوف فون إيتشل شترايبر من tgcBIOMICS GmbH (بينجن ، ألمانيا) لتوفير مستضدات بوريليا المستخدمة في الدراسة. تم الحصول على عينات مصل بشرية للتحقق من صحة الفحص الفني ومراقبة الجودة من: 1) دراسة الانتشار التسلسلي والمتعدد على الأجسام المضادة ضد SARS-CoV-2 في ألمانيا عبر قسم علم الأوبئة ، مركز هيلمهولتز لأبحاث العدوى ، براونشفايغ ، ألمانيا. و 2) قسم طب الأعصاب ، Sächsisches Krankenhaus Rodewisch (رودويش ، ألمانيا). تم منح الموافقة على استخدام العينات البشرية من قبل لجنة الأخلاقيات في كلية الطب في هانوفر ، ألمانيا (9086_BO_S_2020).
Materials
| Antibodies and Detection Reagents | Source | Catalog Number | |
| Biotinylated Goat Anti-Human IgG | Jackson ImmunoResearch (Dianova) | 109-066-098 | |
| Brilliant Violet 421-Streptavidin | BD Biosciences | 563259 | |
| Donkey Anti-Human IgM | Jackson ImmunoResearch (Dianova) | 709-116-073 | |
| Borrelia Antigens | tgcBIOMICS (Bingen, Germany) | ||
| Coupling Reagents | |||
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific Pierce | 77149 ProteoChem (100 mg) | |
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| BSA | Carl Roth | T844.3 | |
| MES (2-ethanesulfonic acid; zwitterionic buffer) | Carl Roth | 4256.2 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | 4984.1 | |
| ProClin300 | Sigma | 48914-U | |
| Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | Thermo Scientific Pierce | 24510 (500 mg) | |
| Triton X-100 | Thermo Scientific | 85111 | |
| Instrumentation and Ancillary Lab Supplies | Source | ||
| 384-well plate | Corning, Cat# 3570 | ||
| 96-well deep-well plates | ThermoFisher Scientific, Cat# 95040450 | ||
| 96-well half-area plates | Corning, Cat# 3690 | ||
| BioTek 405 TS Plate Washer | BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| BioTek MultiFlo FX Plate Washer | BioTek Instruments/Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| DynaMag Spin Magnet (for isolating beads in microcentrifuge tubes) | ThermoFisher, Cat# 12320D | ||
| Flexmap 3D (two-channel, single-reporter instrument) | Luminex Corp., Austin, TX | ||
| KingFisher Magnetic Particle Processor (for isolating beads in 96-well plates) | ThermoFisher, Cat# A31508 | ||
| MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) | Luminex Corp., Austin, TX | ||
| SmartBlock Plates | Eppendorf, Cat# 5363000039 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf, Cat# 5382000015 | ||
| ThermoTop | Eppendorf, Cat# 5308000003 | ||
| xMAP Intelliflex (three-channel, dual-reporter instrument) | Luminex Corp., Austin, TX |
Referências
- Stanek, G., Strle, F. Lyme borreliosis-from tick bite to diagnosis and treatment. FEMS Microbiology Reviews. 42 (3), 233-258 (2018).
- Stanek, G., Wormser, G. P., Gray, J., Strle, F. Lyme borreliosis. The Lancet. 379 (9814), 461-473 (2012).
- Rizzoli, A., et al. Lyme borreliosis in Europe. Eurosurveillance. 16 (27), 19906 (2011).
- Cook, M. J. Lyme borreliosis: a review of data on transmission time after tick attachment. International Journal of General Medicine. 8, 1-8 (2015).
- Strle, F., Stanek, G., Lipsker, D., Jaulhac, B. Clinical Manifestations and Diagnosis of Lyme Borreliosis. Lyme Borreliosis: Biological and Clinical Aspects. , 51-110 (2009).
- Wilske, B., Fingerle, V., Schulte-Spechtel, U. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 49 (1), 13-21 (2007).
- Dessau, R. B., et al. To test or not to test? Laboratory support for the diagnosis of Lyme borreliosis: a position paper of ESGBOR, the ESCMID study group for Lyme borreliosis. Clinical Microbiology and Infection. 24 (2), 118-124 (2018).
- Eldin, C., et al. Review of European and American guidelines for the diagnosis of Lyme borreliosis. Médecine et Maladies Infectieuses. 49 (2), 121-132 (2019).
- Lantos, P. M., et al. Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America (IDSA), American Academy of Neurology (AAN), and American College of Rheumatology (ACR): 2020 Guidelines for the Prevention, Diagnosis and Treatment of Lyme Disease. Clinical Infectious Diseases. 72 (1), e1-e48 (2021).
- Gerritzen, A., Brandt, S. Serodiagnosis of Lyme borreliosis with bead based immunoassays using multiplex technology. Methods. 56 (4), 477-483 (2012).
- Embers, M. E., et al. Five-antigen fluorescent bead-based assay for diagnosis of Lyme disease. Clinical Vaccine Immunology. 23 (4), 294-303 (2016).
- Häring, J., et al. Borrelia multiplex: a bead-based multiplex assay for the simultaneous detection of Borrelia specific IgG/IgM class antibodies. BMC Infectious Diseases. 22 (1), 859 (2022).
- Angeloni, S., Cameron, A., Pecora, N. D., Dunbar, S. A rapid, multiplex dual reporter IgG and IgM SARS-CoV-2 neutralization assay for a multiplexed bead-based flow analysis system. Journal of Visualized Experiments. 170, (2021).
- Gornyk, D., et al. SARS-CoV-2 Seroprevalence in Germany. Deutsches Ärzteblatt International. 118 (48), 824-831 (2021).
- Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. . xMAP Cookbook. , (2022).
- Racine, R., Winslow, G. M. IgM in microbial infections: Taken for granted. Immunology Letters. 125 (2), 79-85 (2009).
- Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature Reviews Immunology. 10 (11), 778-786 (2010).
- Kovaleski, G., et al. Extraction and purification of phycobiliproteins from algae and their applications. Frontiers in Chemistry. 10, 1065355 (2022).
- Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: A new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry Part A. 81 (6), 456-466 (2012).
- Coors, A., et al. Regional seropositivity for Borrelia burgdorferi and associated risk factors: findings from the Rhineland Study, Germany. Parasites & Vectors. 15 (1), 241 (2022).
- Gürsoy, M., et al. Salivary IgA and IgG antibody responses against periodontitis-associated bacteria in Crohn’s Disease. International Journal of Molecular Science. 24 (3), 2385 (2023).
- Argani, H. Anti-HLA Antibody: The role of epitopes in organ transplantation. Experimental and Clinical Transplantation. 17 (Suppl 1), 38-42 (2019).
- Laman, J. D., Huizinga, R., Boons, G. J., Jacobs, B. C. Guillain-Barré syndrome: expanding the concept of molecular mimicry. Trends in Immunology. 43 (4), 296-308 (2022).
