Dette arbeidet demonstrerer bruken av en multimodal ultralydbasert bildebehandlingsplattform for ikke-invasiv avbildning av iskemisk slag. Dette systemet muliggjør kvantifisering av oksygenering av blod gjennom fotoakustisk avbildning og nedsatt perfusjon i hjernen gjennom akustisk angiografi.
Presentert her er en eksperimentell iskemisk hjerneslagstudie ved hjelp av vårt nyutviklede ikke-invasive bildebehandlingssystem som integrerer tre akustisk-baserte bildebehandlingsteknologier: fotoakustisk, ultralyd og angiografisk tomografi (PAUSAT). Kombinere disse tre modalitetene bidrar til å skaffe multispektral fotoakustisk tomografi (PAT) av hjernens oksygenering av blod, høyfrekvent ultralydavbildning av hjernevevet og akustisk angiografi av cerebral blodperfusjon. Den multimodale bildebehandlingsplattformen gjør det mulig å studere cerebrale perfusjons- og oksygeneringsendringer i hele musehjernen etter hjerneslag. To ofte brukte iskemiske slagmodeller ble evaluert: den permanente midtre cerebrale arterieokklusjonsmodellen (pMCAO) og fototrombotisk (PT) modell. PAUSAT ble brukt til å avbilde de samme musehjernene før og etter et slag og kvantitativt analysere begge slagmodellene. Dette bildesystemet kunne tydelig vise hjernens vaskulære forandringer etter iskemisk hjerneslag, inkludert signifikant redusert blodperfusjon og oksygenering i slaginfarktregionen (ipsilateralt) sammenlignet med det uskadde vevet (kontralateralt). Resultatene ble bekreftet av både laserspeckle kontrastavbildning og trifenyltetrazoliumklorid (TTC) farging. Videre ble slaginfarktvolumet i begge slagmodellene målt og validert med TTC-farging som grunnsannhet. Gjennom denne studien har vi vist at PAUSAT kan være et kraftig verktøy i ikke-invasive og longitudinelle prekliniske studier av iskemisk hjerneslag.
Blod transporterer oksygen (via hemoglobinproteinet) og andre viktige næringsstoffer til vev i kroppen vår. Når blodstrømmen gjennom vev avbrytes (iskemi), kan det oppstå alvorlig skade på vevet, hvis mest umiddelbare effekter skyldes mangel på oksygen (hypoksi). Iskemisk slag er resultatet av avbrutt blodstrøm til en bestemt region i hjernen. Hjerneskaden som følge av et iskemisk slag kan oppstå i løpet av minutter etter blokkering av fartøyet, og kan ofte ha svekkende og varige effekter 1,2. En svært verdifull strategi for å evaluere fysiopatologien etter iskemisk hjerneslag og identifisere og teste nye behandlinger er bruken av smådyrmodeller i laboratoriet. Behandlinger oppdaget i laboratoriet tar sikte på å bli oversatt til klinisk bruk og forbedre pasientens liv. Imidlertid må bruken av dyr i biomedisinsk forskning vurderes nøye i henhold til Russell og Burchs 3Rs-prinsipper: erstatning, reduksjon og forfining3. Målet med reduksjonskomponenten er å redusere antall dyr uten at det går på bekostning av datainnsamlingen. Med dette i bakhodet gir det å kunne evaluere lesjonsutviklingen i lengderetningen via ikke-invasiv avbildning en stor fordel når det gjelder å redusere antall dyr som kreves, samt maksimere informasjonen fra hvert dyr4.
Fotoakustisk tomografi (PAT) er en hybrid bildebehandlingsmodalitet som kombinerer optisk absorpsjonskontrast med ultralydavbildning romlig oppløsning5. Bildemekanismen til PAT er som følger. En eksitasjonslaserpuls lyser på målet som avbildes. Forutsatt at målet absorberer lys ved bølgelengden til eksitasjonslaseren, vil den øke i temperatur. Denne raske temperaturøkningen resulterer i en termoelastisk utvidelse av målet. Utvidelsen fører til at en ultralydbølge forplanter seg ut fra målet. Ved å oppdage ultralydbølgen i mange posisjoner, kan tiden det tar for bølgen å forplante seg fra målet til detektorene brukes til å lage et bilde gjennom en rekonstruksjonsalgoritme. Evnen til PAT til å oppdage optisk absorpsjon i dype vevsregioner skiller PAT fra ultralydavbildning, som oppdager grenser for forskjellige akustiske impedanser av vev5. I de synlige og nær-infrarøde spektrene er de primære høyt absorberende biomolekylene som er rikelig i organismer hemoglobin, lipider, melanin og vann7. Av spesiell interesse for studiet av hjerneslag er hemoglobin. Siden oksyhemoglobin og deoksyhemoglobin har forskjellige optiske absorpsjonsspektra, kan PAT brukes med flere eksitasjonslaserbølgelengder for å bestemme den relative konsentrasjonen av de to tilstandene i proteinet. Dette gjør at oksygenmetningen av hemoglobin (sO2), eller oksygenering av blod, kan kvantifiseres i og utenfor infarktområdet 8,9. Dette er et viktig tiltak i iskemisk slag, da det kan indikere nivået av oksygen i det skadede hjernevævet etter iskemi.
Akustisk angiografi (AA) er en kontrastforsterket ultralydavbildningsmetode som er spesielt nyttig for avbildning av morfologien til vaskulatur in vivo10. Metoden er avhengig av bruk av en dobblersvinger (et lavfrekvent element og et høyfrekvent element) i forbindelse med mikrobobler injisert i sirkulasjonssystemet til bildesubjektet. Det lavfrekvente elementet i transduseren brukes til overføring ved resonansfrekvensen til mikroboblene (f.eks. 2 MHz), mens høyfrekvente element brukes til å motta superharmoniske signaler fra mikroboblene (f.eks. 26 MHz). Når de eksiteres ved en resonansfrekvens, har mikroboblene en sterk ikke-lineær respons, noe som resulterer i produksjon av superharmoniske signaler om at omgivende kroppsvev ikke produserer11. Ved å motta med et høyfrekvent element, sikrer dette at bare mikroboblesignalene oppdages. Siden mikroboblene er begrenset til blodkarene, er resultatet et angiografisk bilde av blodkarmorfologi. AA er en kraftig metode for avbildning av iskemisk slag, da mikroboblene som strømmer gjennom sirkulasjonssystemet, ikke kan strømme gjennom blokkerte kar. Dette gjør det mulig for AA å oppdage regioner i hjernen som ikke er perfusert på grunn av iskemisk slag, noe som indikerer infarktområdet.
Preklinisk iskemisk hjerneslagforskning er generelt avhengig av bruk av histologi og atferdstesting for å vurdere plasseringen og alvorlighetsgraden av hjerneslaget. Trifenyltetrazoliumklorid (TTC) farging er en vanlig histologisk analyse som brukes til å bestemme slaginfarktvolumet. Det kan imidlertid bare brukes på et endepunkt, siden det krever at dyret avlives12. Atferdstester kan brukes til å bestemme motorisk funksjonsnedsettelse på flere tidspunkter, men de kan ikke gi kvantitative anatomiske eller fysiologiske verdier13. Biomedisinsk bildebehandling gir en mer kvantitativ tilnærming til å studere effekten av iskemisk hjerneslag ikke-invasivt og langsgående 9,14,15. Imidlertid kan eksisterende bildebehandlingsteknologier (for eksempel smådyrmagnetisk resonansavbildning [MRI]) komme til en høy pris, ikke kunne gi samtidig strukturell og funksjonell informasjon, eller ha begrenset penetrasjonsdybde (som de fleste optiske bildebehandlingsteknikker).
Her kombinerer vi fotoakustisk, ultralyd og angiografisk tomografi (PAUSAT; se systemdiagram i figur 1), som muliggjør komplementær strukturell og funksjonell informasjon om blodperfusjon og oksygenering etter iskemisk hjerneslag16. Dette er to viktige aspekter ved å vurdere alvorlighetsgraden av skade og overvåke gjenoppretting eller respons på behandlinger. Ved hjelp av disse integrerte bildebehandlingsmetodene kan øke mengden informasjon som er oppnådd av hvert dyr, redusere antall dyr som kreves og gi mer informasjon i studiet av potensielle behandlinger for iskemisk slag.
Figur 1: PAUSAT-diagram. (A) Komplett skjematisk fremstilling av PAUSAT-systemet, inkludert laseren og OPO som brukes til PAT. (B) Sett fra innsiden av PAUSAT-systemet, inkludert to ultralydtransdusere. Dual-element wobblertransduseren brukes til både B-modus ultralyd og AA, og lineær-array-transduseren brukes til PAT. Begge transduserne er montert på samme 2D-motoriserte trinn, noe som gjør det mulig for skanning å generere volumetriske data. Dette tallet er endret fra16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Det er noen viktige aspekter ved denne metoden som, hvis den gjøres feil, kan føre til betydelig redusert bildekvalitet og kvantitativ analyse. Det vanligste resultatet av brukerfeil i PAUSAT-bilder er enten mangel på signal eller svært lav signalstyrke, som begge kan oppstå av en rekke årsaker. En slik grunn er et problem med den akustiske koblingen. Store luftbobler i vannet som omgir musens hode under avbildning kan ofte blokkere ultralydet fra å reise til eller fra transduseren, noe som forårsaker et skyggeom…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne ingeniørteamet hos SonoVol Inc. for deres tekniske støtte. Dette arbeidet ble delvis sponset av American Heart Association Collaborative Sciences Award (18CSA34080277), til J. Yao og W. Yang; USAs National Institutes of Health (NIH) gir R21EB027981, R21 EB027304, RF1 NS115581 (BRAIN Initiative), R01 NS111039, R01 EB028143; USAs National Science Foundation (NSF) KARRIEREPRIS 2144788; Chan Zuckerberg Initiative Grant (2020-226178), til J. Yao; og NIH gir R21NS127163 og R01NS099590 til W. Yang.
20 GA catheter | BD Insyte Autoguard Winged | 381534 | For mouse intubation |
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | Necessary for TTC-staining brain for validation |
532nm Laser | Quantel | Q-smart 850 | Laser used to pump the OPO for PAT |
Automatic Ventilator Rovent Jr. | Kent Scientific | RV-JR | To keep mice under anesthesia during surgical procedure |
Black braided silk 4-0 USP | Surgical Specialties | SP116 | Used for sutures on the neck for pMCAO surgery |
Bupivacaine | Hospira | 0409-1159-18 | Used prior to closing wounds during surgical procedure |
C57BL/6 Mice | Jackson Lab | #000664 | Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female) |
Clear suture | Ethicon | 8606 | Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT |
Cold Light LED | Schott | KL 1600 | Needed to create PT stroke |
Disposable Razor Blade | Accutec Blades | 74-0002 | For sectioning mouse brain |
Electric drill | JSDA | JD-700 | Used to expose MCA during pMCAO procedure |
Electrocauterization tool | Wet-Field | Wet-Field Bipolar-RG | Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure |
Hair removal gel | Veet | 8282651 | Used to remove hair from mouse prior to imaging |
High Temperature Cautery Loop Tip | BOVIE Medical Corporation | REF AA03 | Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull |
IR Detector Card | Thorlabs | VRC5 | Used to ensure light path is aligned |
Laser Power Meter | Ophir | StarBright, P/N 7Z01580 | Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging |
Laser Speckle Imaging System | RWD Life Science Co. | RFLSI-III | Can be used to validate stroke surgery success |
Lubricant Eye Ointment | Soothe | AB31336 | Can be used to avoid drying of the eyes |
Manually adjustable stage | Thorlabs | L490 | Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging |
Modified Vega Imaging System | Perkin Elmer | LLA00061 | System containing both B-mode/AA and PAT transducers |
Optical Parametric Oscillator | Quantel | versaScan-L532 | Allows for tuning of excitation wavelength in a large range |
Programmable Ultrasound System | Verasonics | Vantage 256 | Used for PAT part of system |
Rose Bengal | Sigma | 330000 | Necessary to induce PT stroke |
Suture | LOOK | SP116 | Used for permanent ligation of CCA |
Temperature Contoller | Physitemp | TCAT-2 | Used to maintain stable body temperature of mice during procedures |
VesselVue Microbubbles | Perkin Elmer | P-4007001 | Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL) |