虚血性脳卒中の非侵襲的全脳イメージングのための統合光音響、超音波、および血管造影断層撮影(PAUSAT)
Summary
この研究は、虚血性脳卒中の非侵襲的イメージングのためのマルチモーダル超音波ベースのイメージングプラットフォームの使用を示しています。このシステムは、光音響イメージングによる血液酸素化の定量化と、音響血管造影による脳内の灌流障害の定量化を可能にします。
Abstract
ここでは、光音響、超音波、血管造影断層撮影(PAUSAT)の3つの音響ベースのイメージング技術を統合した、新しく開発された非侵襲的イメージングシステムを使用した実験的虚血性脳卒中研究を紹介します。これら3つのモダリティを組み合わせることで、脳血液酸素化のマルチスペクトル光音響断層撮影(PAT)、脳組織の高周波超音波イメージング、脳血液灌流の音響血管造影が可能になります。マルチモーダルイメージングプラットフォームは、脳卒中後のマウス脳全体の脳灌流および酸素化変化の研究を可能にする。一般的に使用される2つの虚血性脳卒中モデル、永久中大脳動脈閉塞(pMCAO)モデルと光血栓(PT)モデルが評価されました。PAUSATは、脳卒中前後の同じマウス脳を画像化し、両方の脳卒中モデルを定量的に解析するために使用されました。この画像システムは、無傷組織(対側)と比較して、脳卒中梗塞領域(同側)の血液灌流と酸素化の有意な減少を含む、虚血性脳卒中後の脳血管の変化を明確に示すことができました。結果は、レーザースペックルコントラストイメージングとトリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色の両方によって確認されました。さらに、両方の脳卒中モデルにおける脳卒中梗塞体積を測定し、グラウンドトゥルースとしてTTC染色によって検証した。この研究を通じて、PAUSATが虚血性脳卒中の非侵襲的および縦断的前臨床試験において強力なツールになり得ることを実証しました。
Introduction
血液は酸素(ヘモグロビンタンパク質を介して)やその他の重要な栄養素を体内の組織に輸送します。組織を通る血流が中断されると(虚血)、組織に深刻な損傷が起こり得、その最も直接的な影響は酸素欠乏(低酸素症)によるものです。虚血性脳卒中は、脳の特定の領域への血流の中断の結果です。虚血性脳卒中に起因する脳損傷は、血管閉塞から数分以内に発生する可能性があり、多くの場合、衰弱させ、永続的な影響を与える可能性があります1,2。虚血性脳卒中後の生理病理学を評価し、新しい治療法を特定してテストするための非常に価値のある戦略は、実験室での小動物モデルの使用です。研究室で発見された治療法は、臨床使用に変換され、患者の生活を改善することを目的としています。ただし、生物医学研究における動物の使用は、ラッセルとバーチの3R原則(交換、削減、改良)に従って慎重に評価する必要があります3。削減コンポーネントの目的は、データ収集を損なうことなく動物の数を減らすことです。このことを前提として、非侵襲的なイメージングによって病変の進展を縦断的に評価できることは、必要な動物数を減らすとともに、各動物から得られる情報を最大化する上で大きな利点となります4。
光音響断層撮影(PAT)は、光吸収コントラストと超音波イメージング空間分解能5を組み合わせたハイブリッドイメージングモダリティです。PATの撮像メカニズムは以下の通りである。励起レーザーパルスは、画像化されているターゲットに照射されます。ターゲットが励起レーザーの波長の光を吸収すると仮定すると、温度が上昇します。この急激な温度上昇により、ターゲットが熱弾性膨張します。膨張により、超音波がターゲットから伝播します。多くの位置で超音波を検出することにより、波がターゲットから検出器に伝播するのに必要な時間を使用して、再構成アルゴリズムを介して画像を作成できます。深部組織領域における光吸収を検出するPATの能力は、PATを、組織の異なる音響インピーダンスの境界を検出する超音波イメージングと区別する5。可視および近赤外スペクトルにおいて、生物に豊富に存在する主要な高吸収生体分子は、ヘモグロビン、脂質、メラニン、および水です7。脳卒中の研究において特に興味深いのはヘモグロビンである。オキシヘモグロビンとデオキシヘモグロビンは異なる光吸収スペクトルを有するので、PATを複数の励起レーザー波長と共に使用して、タンパク質の2つの状態の相対濃度を決定することができる。これにより、ヘモグロビンの酸素飽和度(sO2)、または血液酸素化を、梗塞領域の内外で定量することができます8,9。これは、虚血後の損傷した脳組織の酸素レベルを示す可能性があるため、虚血性脳卒中の重要な尺度です。
音響血管造影(AA)は、 インビボ10における血管系の形態を画像化するのに特に有用である造影増強超音波画像化法である。この方法は、イメージング対象の循環系に注入されたマイクロバブルと組み合わせて、2素子のワブラートランスデューサ(低周波素子と高周波素子)を使用することに依存しています。トランスデューサの低周波素子はマイクロバブルの共振周波数(例えば2MHz)での送信に使用され、高周波素子はマイクロバブルの超高調波信号(例えば26MHz)を受信するために使用される。共振周波数で励起されると、マイクロバブルは強い非線形応答を持ち、その結果、周囲の体組織が生成しない超高調波信号が生成されます11。高周波素子で受信することで、マイクロバブル信号のみを確実に検出します。マイクロバブルは血管に閉じ込められているため、血管形態の血管造影画像が得られます。AAは、循環器系を流れるマイクロバブルが閉塞した血管を流れることができないため、虚血性脳卒中を画像化するための強力な方法です。これにより、AAは、梗塞領域を示す虚血性脳卒中のために灌流されていない脳の領域を検出することができます。
前臨床虚血性脳卒中研究は、一般に、脳卒中の位置と重症度を評価するために組織学と行動検査の使用に依存しています。トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)染色は、脳卒中梗塞体積を決定するために使用される一般的な組織学的分析です。ただし、動物を安楽死させる必要があるため、エンドポイントでのみ使用できます12。行動テストは、複数の時点での運動機能障害を決定するために使用できますが、定量的な解剖学的または生理学的値を提供することはできません13。生物医学画像は、虚血性脳卒中の影響を非侵襲的かつ縦断的に研究するためのより定量的なアプローチを提供します9、14、15。ただし、既存のイメージング技術(小動物磁気共鳴画像法[MRI]など)は、コストが高く、構造的および機能的情報を同時に提供できないか、または侵入深さが制限される可能性があります(ほとんどの光学イメージング技術と同様)。
ここでは、光音響、超音波、血管造影断層撮影(PAUSAT;図1のシステム 図を参照)を組み合わせて、虚血性脳卒中後の血液灌流と酸素化の補完的な構造的および機能的情報を可能にします16。これらは、傷害の重症度を評価し、治療に対する回復または反応を監視する上で2つの重要な側面です。これらの統合されたイメージング方法を使用すると、各動物によって取得される情報量を増やし、必要な動物の数を減らし、虚血性脳卒中の潜在的な治療法の研究においてより多くの情報を提供することができます。
図1:パウサット図。 (A)PATに使用されるレーザーとOPOを含むPAUSATシステムの完全な回路図。 (B)2つの超音波トランスデューサを含むPAUSATシステムの内部図。二振動子型ワブラー探触子はBモード超音波と単三振動子の両方に使用され、リニアアレイ探触子はPATに使用されます。両方のトランスデューサは同じ2D電動ステージに取り付けられているため、スキャンして体積データを生成できます。この図は16から変更されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法には、誤って行うと画質と定量分析が大幅に低下する可能性のある重要な側面がいくつかあります。PAUSAT画像でユーザーエラーが発生する最も一般的な結果は、信号の欠如または非常に低い信号強度のいずれかであり、どちらもさまざまな理由で発生する可能性があります。そのような理由の1つは、音響結合の問題です。イメージング中にマウスの頭部を囲む水中の大きな気泡は、…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、SonoVol Inc.のエンジニアリングチームの技術サポートに感謝したいと思います。この研究は、米国心臓協会の共同科学賞(18CSA34080277)によって部分的に後援され、J.ヤオとW.ヤンに贈られました。米国国立衛生研究所(NIH)は、R21EB027981、R21 EB027304、RF1 NS115581(BRAINイニシアチブ)、R01 NS111039、R01 EB028143を助成します。米国国立科学財団(NSF)キャリア賞2144788;チャンザッカーバーグイニシアチブ助成金(2020-226178)、J.ヤオへ。NIHはW.ヤンにR21NS127163とR01NS099590を付与します。
Materials
| 20 GA catheter | BD Insyte Autoguard Winged | 381534 | For mouse intubation |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | Necessary for TTC-staining brain for validation |
| 532nm Laser | Quantel | Q-smart 850 | Laser used to pump the OPO for PAT |
| Automatic Ventilator Rovent Jr. | Kent Scientific | RV-JR | To keep mice under anesthesia during surgical procedure |
| Black braided silk 4-0 USP | Surgical Specialties | SP116 | Used for sutures on the neck for pMCAO surgery |
| Bupivacaine | Hospira | 0409-1159-18 | Used prior to closing wounds during surgical procedure |
| C57BL/6 Mice | Jackson Lab | #000664 | Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female) |
| Clear suture | Ethicon | 8606 | Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT |
| Cold Light LED | Schott | KL 1600 | Needed to create PT stroke |
| Disposable Razor Blade | Accutec Blades | 74-0002 | For sectioning mouse brain |
| Electric drill | JSDA | JD-700 | Used to expose MCA during pMCAO procedure |
| Electrocauterization tool | Wet-Field | Wet-Field Bipolar-RG | Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure |
| Hair removal gel | Veet | 8282651 | Used to remove hair from mouse prior to imaging |
| High Temperature Cautery Loop Tip | BOVIE Medical Corporation | REF AA03 | Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull |
| IR Detector Card | Thorlabs | VRC5 | Used to ensure light path is aligned |
| Laser Power Meter | Ophir | StarBright, P/N 7Z01580 | Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging |
| Laser Speckle Imaging System | RWD Life Science Co. | RFLSI-III | Can be used to validate stroke surgery success |
| Lubricant Eye Ointment | Soothe | AB31336 | Can be used to avoid drying of the eyes |
| Manually adjustable stage | Thorlabs | L490 | Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging |
| Modified Vega Imaging System | Perkin Elmer | LLA00061 | System containing both B-mode/AA and PAT transducers |
| Optical Parametric Oscillator | Quantel | versaScan-L532 | Allows for tuning of excitation wavelength in a large range |
| Programmable Ultrasound System | Verasonics | Vantage 256 | Used for PAT part of system |
| Rose Bengal | Sigma | 330000 | Necessary to induce PT stroke |
| Suture | LOOK | SP116 | Used for permanent ligation of CCA |
| Temperature Contoller | Physitemp | TCAT-2 | Used to maintain stable body temperature of mice during procedures |
| VesselVue Microbubbles | Perkin Elmer | P-4007001 | Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL) |
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