यह काम इस्केमिक स्ट्रोक के नॉनइनवेसिव इमेजिंग के लिए एक मल्टीमॉडल अल्ट्रासाउंड-आधारित इमेजिंग प्लेटफॉर्म के उपयोग को दर्शाता है। यह प्रणाली ध्वनिक एंजियोग्राफी के माध्यम से मस्तिष्क में फोटोएकॉस्टिक इमेजिंग और बिगड़ा हुआ छिड़काव के माध्यम से रक्त ऑक्सीकरण की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देती है।
यहां प्रस्तुत हमारे नए विकसित नॉनइनवेसिव इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके एक प्रयोगात्मक इस्केमिक स्ट्रोक अध्ययन है जो तीन ध्वनिक-आधारित इमेजिंग प्रौद्योगिकियों को एकीकृत करता है: फोटोएकॉस्टिक, अल्ट्रासाउंड और एंजियोग्राफिक टोमोग्राफी (पीएयूएसएटी)। इन तीन तौर-तरीकों के संयोजन से मस्तिष्क रक्त ऑक्सीकरण की बहु-वर्णक्रमीय फोटोएकॉस्टिक टोमोग्राफी (पीएटी), मस्तिष्क के ऊतकों की उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड इमेजिंग और सेरेब्रल रक्त छिड़काव की ध्वनिक एंजियोग्राफी प्राप्त करने में मदद मिलती है। मल्टी-मोडल इमेजिंग प्लेटफॉर्म स्ट्रोक के बाद पूरे माउस मस्तिष्क में मस्तिष्क छिड़काव और ऑक्सीजन परिवर्तन के अध्ययन की अनुमति देता है। दो आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले इस्केमिक स्ट्रोक मॉडल का मूल्यांकन किया गया था: स्थायी मध्य सेरेब्रल धमनी रोड़ा (पीएमसीएओ) मॉडल और फोटोथ्रोम्बोटिक (पीटी) मॉडल। PAUSAT का उपयोग स्ट्रोक से पहले और बाद में एक ही माउस दिमाग की छवि बनाने और मात्रात्मक रूप से दोनों स्ट्रोक मॉडल का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। यह इमेजिंग सिस्टम इस्केमिक स्ट्रोक के बाद मस्तिष्क संवहनी परिवर्तनों को स्पष्ट रूप से दिखाने में सक्षम था, जिसमें अघायल ऊतक (विपरीत) की तुलना में स्ट्रोक इन्फ्रैक्ट क्षेत्र (मस्तिष्क) में रक्त छिड़काव और ऑक्सीकरण में काफी कमी आई है। परिणामों की पुष्टि लेजर स्पॉट कंट्रास्ट इमेजिंग और ट्राइफेनिलटेट्राज़ोलियम क्लोराइड (टीटीसी) स्टेनिंग दोनों द्वारा की गई थी। इसके अलावा, दोनों स्ट्रोक मॉडल में स्ट्रोक इन्फ्रैक्ट वॉल्यूम को टीटीसी स्टेनिंग द्वारा जमीनी सच्चाई के रूप में मापा और मान्य किया गया था। इस अध्ययन के माध्यम से, हमने प्रदर्शित किया है कि पीएयूएसएटी इस्केमिक स्ट्रोक के गैर-आक्रामक और अनुदैर्ध्य प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है।
रक्त हमारे शरीर में ऊतकों को ऑक्सीजन (हीमोग्लोबिन प्रोटीन के माध्यम से) और अन्य महत्वपूर्ण पोषक तत्वों का परिवहन करता है। जब ऊतकों के माध्यम से रक्त का प्रवाह बाधित होता है (इस्किमिया), ऊतकों को गंभीर नुकसान हो सकता है, जिनमें से सबसे तत्काल प्रभाव ऑक्सीजन की कमी (हाइपोक्सिया) के कारण होते हैं। इस्केमिक स्ट्रोक मस्तिष्क के एक निश्चित क्षेत्र में बाधित रक्त प्रवाह का परिणाम है। इस्केमिक स्ट्रोक से उत्पन्न मस्तिष्क क्षति एक पोत रुकावट के मिनटों के भीतर हो सकती है, और अक्सर दुर्बल और स्थायी प्रभाव हो सकती है 1,2. इस्केमिक स्ट्रोक के बाद फिजियोपैथोलॉजी का मूल्यांकन करने और नए उपचारों की पहचान और परीक्षण करने के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान रणनीति प्रयोगशाला में छोटे-पशु मॉडल का उपयोग है। प्रयोगशाला में खोजे गए उपचारों का उद्देश्य नैदानिक उपयोग के लिए अनुवाद किया जाना है और रोगियों के जीवन में सुधार करना है। हालांकि, बायोमेडिकल अनुसंधान में जानवरों के उपयोग को रसेल और बर्च के 3 आर सिद्धांतों के अनुसार सावधानीपूर्वक मूल्यांकन करने की आवश्यकता है: प्रतिस्थापन, कमी और शोधन3। कमी घटक का उद्देश्य डेटा संग्रह से समझौता किए बिना जानवरों की संख्या को कम करना है। इसे ध्यान में रखते हुए, नॉनइनवेसिव इमेजिंग के माध्यम से घाव के विकास का अनुदैर्ध्य मूल्यांकन करने में सक्षम होने से आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करने में बहुत लाभ होता है, साथ ही साथ प्रत्येक जानवर से प्राप्त जानकारी को अधिकतम किया जा सकताहै।
फोटोएकॉस्टिक टोमोग्राफी (पीएटी) एक हाइब्रिड इमेजिंग मोडिटी है जो अल्ट्रासाउंड इमेजिंग स्थानिक रिज़ॉल्यूशन5 के साथ ऑप्टिकल अवशोषण कंट्रास्ट को जोड़ती है। पीएटी का इमेजिंग तंत्र इस प्रकार है। एक उत्तेजना लेजर पल्स को छवि किए जा रहे लक्ष्य पर रोशन किया जाता है। यह मानते हुए कि लक्ष्य उत्तेजना लेजर की तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश को अवशोषित करता है, यह तापमान में वृद्धि होगी। तापमान में इस त्वरित वृद्धि के परिणामस्वरूप लक्ष्य का थर्मोइलास्टिक विस्तार होता है। विस्तार एक अल्ट्रासाउंड लहर को लक्ष्य से बाहर फैलाने का कारण बनता है। कई स्थितियों में अल्ट्रासाउंड तरंग का पता लगाकर, तरंग को लक्ष्य से डिटेक्टरों तक फैलाने के लिए आवश्यक समय का उपयोग पुनर्निर्माण एल्गोरिथ्म के माध्यम से एक छवि बनाने के लिए किया जा सकता है। गहरे ऊतक क्षेत्रों में ऑप्टिकल अवशोषण का पता लगाने के लिए पीएटी की क्षमता अल्ट्रासाउंड इमेजिंग से पीएटी को अलग करती है, जो ऊतकों के विभिन्न ध्वनिक प्रतिबाधा की सीमाओं का पता लगातीहै। दृश्यमान और निकट-अवरक्त स्पेक्ट्रा में, जीवों में प्रचुर मात्रा में पाए जाने वाले प्राथमिक अत्यधिक अवशोषित बायोमोलेक्यूल्स हीमोग्लोबिन, लिपिड, मेलेनिन और पानी7 हैं। स्ट्रोक के अध्ययन में विशेष रुचि हीमोग्लोबिन है। चूंकि ऑक्सीहीमोग्लोबिन और डीऑक्सीहीमोग्लोबिन में अलग-अलग ऑप्टिकल अवशोषण स्पेक्ट्रा होते हैं, इसलिए प्रोटीन के दो राज्यों की सापेक्ष एकाग्रता निर्धारित करने के लिए पीएटी का उपयोग कई उत्तेजना लेजर तरंग दैर्ध्य के साथ किया जा सकता है। यह हीमोग्लोबिन (एसओ2), या रक्त ऑक्सीकरण की ऑक्सीजन संतृप्ति को इन्फ्रैक्ट क्षेत्र 8,9 के अंदर और बाहर निर्धारित करने की अनुमति देता है। इस्केमिक स्ट्रोक में यह एक महत्वपूर्ण उपाय है, क्योंकि यह इस्किमिया के बाद क्षतिग्रस्त मस्तिष्क के ऊतकों में ऑक्सीजन के स्तर का संकेत दे सकता है।
ध्वनिक एंजियोग्राफी (एए) एक कंट्रास्ट-एन्हांस्ड अल्ट्रासाउंड इमेजिंग विधि है जो विवो10 में वाहिका की आकृति विज्ञान की इमेजिंग के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। विधि इमेजिंग विषय के संचार प्रणाली में इंजेक्ट किए गए माइक्रोबबल के साथ संयोजन में एक दोहरे तत्व वॉबलर ट्रांसड्यूसर (एक कम आवृत्ति तत्व और एक उच्च आवृत्ति तत्व) के उपयोग पर निर्भर करती है। ट्रांसड्यूसर के कम आवृत्ति तत्व का उपयोग माइक्रोबबल्स (जैसे, 2 मेगाहर्ट्ज) की अनुनाद आवृत्ति पर संचारित करने के लिए किया जाता है, जबकि उच्च आवृत्ति तत्व का उपयोग माइक्रोबबल (जैसे, 26 मेगाहर्ट्ज) के सुपर हार्मोनिक सिग्नल प्राप्त करने के लिए किया जाता है। जब एक अनुनाद आवृत्ति पर उत्तेजित होता है, तो माइक्रोबबल में एक मजबूत नॉनलाइनर प्रतिक्रिया होती है, जिसके परिणामस्वरूप सुपर हार्मोनिक संकेतों का उत्पादन होता है जो शरीर के ऊतकों के आसपास11 का उत्पादन नहीं करते हैं। एक उच्च आवृत्ति तत्व के साथ प्राप्त करके, यह सुनिश्चित करता है कि केवल माइक्रोबबल सिग्नल का पता लगाया जाता है। चूंकि माइक्रोबबल रक्त वाहिकाओं तक ही सीमित हैं, इसलिए परिणाम रक्त वाहिका आकृति विज्ञान की एक एंजियोग्राफिक छवि है। एए इमेजिंग इस्केमिक स्ट्रोक के लिए एक शक्तिशाली तरीका है, क्योंकि संचार प्रणाली के माध्यम से बहने वाले माइक्रोबबल अवरुद्ध वाहिकाओं के माध्यम से बहने में सक्षम नहीं हैं। यह एए को मस्तिष्क के उन क्षेत्रों का पता लगाने की अनुमति देता है जो इस्केमिक स्ट्रोक के कारण प्रभावित नहीं होते हैं, जो इन्फ्रैक्ट क्षेत्र को इंगित करता है।
प्रीक्लिनिकल इस्केमिक स्ट्रोक अनुसंधान आम तौर पर स्ट्रोक के स्थान और गंभीरता का आकलन करने के लिए हिस्टोलॉजी और व्यवहार परीक्षण के उपयोग पर निर्भर करता है। ट्राइफेनिलटेट्राज़ोलियम क्लोराइड (टीटीसी) धुंधला होना एक सामान्य हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण है जिसका उपयोग स्ट्रोक इन्फ्रैक्ट वॉल्यूम को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। हालांकि, इसका उपयोग केवल समापन बिंदु पर किया जा सकता है, क्योंकि इसके लिए जानवर को इच्छामृत्यु की आवश्यकता होतीहै। व्यवहार परीक्षणों का उपयोग कई समय बिंदुओं पर मोटर फ़ंक्शन हानि को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन वे मात्रात्मक शारीरिक या शारीरिक मूल्य प्रदान नहीं कर सकतेहैं। बायोमेडिकल इमेजिंग इस्केमिक स्ट्रोक के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक अधिक मात्रात्मक दृष्टिकोण प्रदान करता है 9,14,15. हालांकि, मौजूदा इमेजिंग प्रौद्योगिकियां (जैसे कि छोटे-पशु चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग [एमआरआई]) उच्च लागत पर आ सकती हैं, समवर्ती संरचनात्मक और कार्यात्मक जानकारी प्रदान करने में असमर्थ हो सकती हैं, या सीमित प्रवेश गहराई (अधिकांश ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीकों के रूप में) हो सकती हैं।
यहां, हम फोटोएकॉस्टिक, अल्ट्रासाउंड और एंजियोग्राफिक टोमोग्राफी (पीएयूएसएटी; चित्रा 1 में सिस्टम आरेख देखें) को जोड़ते हैं, जो इस्केमिक स्ट्रोक16 के बाद रक्त छिड़काव और ऑक्सीकरण की पूरक संरचनात्मक और कार्यात्मक जानकारी की अनुमति देता है। चोट की गंभीरता का आकलन करने और उपचार के लिए वसूली या प्रतिक्रिया की निगरानी में ये दो महत्वपूर्ण पहलू हैं। इन एकीकृत इमेजिंग विधियों का उपयोग करके प्रत्येक जानवर द्वारा प्राप्त जानकारी की मात्रा में वृद्धि हो सकती है, आवश्यक जानवरों की संख्या कम हो सकती है और इस्केमिक स्ट्रोक के लिए संभावित उपचार के अध्ययन में अधिक जानकारी प्रदान की जा सकती है।
चित्र 1: PAUSAT आरेख। (A) पीएटी के लिए उपयोग किए जाने वाले लेजर और ओपीओ सहित PAUSAT प्रणाली का पूरा योजनाबद्ध। (B) दो अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर सहित PAUSAT प्रणाली का आंतरिक दृश्य। दोहरे-तत्व वॉबलर ट्रांसड्यूसर का उपयोग बी-मोड अल्ट्रासाउंड और एए दोनों के लिए किया जाता है, और रैखिक-सरणी ट्रांसड्यूसर का उपयोग पीएटी के लिए किया जाता है। दोनों ट्रांसड्यूसर एक ही 2 डी मोटराइज्ड स्टेज पर लगाए जाते हैं, जिससे वॉल्यूमेट्रिक डेटा उत्पन्न करने के लिए स्कैनिंग की अनुमति मिलती है। इस आंकड़े को16 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
इस विधि के कुछ महत्वपूर्ण पहलू हैं, जो यदि गलत तरीके से किए जाते हैं, तो छवि की गुणवत्ता और मात्रात्मक विश्लेषण में काफी कमी आ सकती है। PAUSAT छवियों में उपयोगकर्ता-त्रुटि का सबसे अधिक होने वाला परिणाम या तो …
The authors have nothing to disclose.
लेखक अपने तकनीकी समर्थन के लिए सोनोवोल इंक में इंजीनियरिंग टीम को स्वीकार करना चाहते हैं। यह काम आंशिक रूप से अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन सहयोगी विज्ञान पुरस्कार (18सीएसए 34080277) द्वारा जे याओ और डब्ल्यू यांग को प्रायोजित किया गया था; संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) R21EB027981, आर 21 EB027304, आरएफ 1 NS115581 (ब्रेन इनिशिएटिव), आर 01 NS111039, आर 01 EB028143; यूनाइटेड स्टेट्स नेशनल साइंस फाउंडेशन (एनएसएफ) कैरियर अवार्ड 2144788; जे याओ को चान जुकरबर्ग पहल अनुदान (2020-226178); और एनआईएच डब्ल्यू यांग को R21NS127163 और R01NS099590 देता है।
20 GA catheter | BD Insyte Autoguard Winged | 381534 | For mouse intubation |
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma | T8877 | Necessary for TTC-staining brain for validation |
532nm Laser | Quantel | Q-smart 850 | Laser used to pump the OPO for PAT |
Automatic Ventilator Rovent Jr. | Kent Scientific | RV-JR | To keep mice under anesthesia during surgical procedure |
Black braided silk 4-0 USP | Surgical Specialties | SP116 | Used for sutures on the neck for pMCAO surgery |
Bupivacaine | Hospira | 0409-1159-18 | Used prior to closing wounds during surgical procedure |
C57BL/6 Mice | Jackson Lab | #000664 | Mice used for studying ischemic stroke (2-6 month old male/female) |
Clear suture | Ethicon | 8606 | Used for closing wound (PT stroke and pMCAO). A clear suture won't interfere with PAT |
Cold Light LED | Schott | KL 1600 | Needed to create PT stroke |
Disposable Razor Blade | Accutec Blades | 74-0002 | For sectioning mouse brain |
Electric drill | JSDA | JD-700 | Used to expose MCA during pMCAO procedure |
Electrocauterization tool | Wet-Field | Wet-Field Bipolar-RG | Stops blood flow after drilling during pMCAO procedure |
Hair removal gel | Veet | 8282651 | Used to remove hair from mouse prior to imaging |
High Temperature Cautery Loop Tip | BOVIE Medical Corporation | REF AA03 | Used to avoid bleeding when separating the temporal muscle from the skull |
IR Detector Card | Thorlabs | VRC5 | Used to ensure light path is aligned |
Laser Power Meter | Ophir | StarBright, P/N 7Z01580 | Can be used to calibrate the laser energy prior to imaging |
Laser Speckle Imaging System | RWD Life Science Co. | RFLSI-III | Can be used to validate stroke surgery success |
Lubricant Eye Ointment | Soothe | AB31336 | Can be used to avoid drying of the eyes |
Manually adjustable stage | Thorlabs | L490 | Used with custom ramp for multiple focal depth AA imaging |
Modified Vega Imaging System | Perkin Elmer | LLA00061 | System containing both B-mode/AA and PAT transducers |
Optical Parametric Oscillator | Quantel | versaScan-L532 | Allows for tuning of excitation wavelength in a large range |
Programmable Ultrasound System | Verasonics | Vantage 256 | Used for PAT part of system |
Rose Bengal | Sigma | 330000 | Necessary to induce PT stroke |
Suture | LOOK | SP116 | Used for permanent ligation of CCA |
Temperature Contoller | Physitemp | TCAT-2 | Used to maintain stable body temperature of mice during procedures |
VesselVue Microbubbles | Perkin Elmer | P-4007001 | Used for acoustic angiography (2.43 × 10^9 microbubbles/mL) |