Оптогенетическое ингибирование Rho1-опосредованной сократимости актомиозина в сочетании с измерением эпителиального натяжения у эмбрионов дрозофилы

Сократительная способность актомиозина, сократительная сила, оказываемая немышечным миозином II (далее «миозин») на F-актиновую сеть, является одной из наиболее важных сил в изменении формы клеток и управлении морфогенезом на тканевом уровне ^1,2. Например, активация сократительной способности актомиозина в апикальном домене эпителиальных клеток приводит к апикальному сужению, что способствует различным морфогенетическим процессам, включая сворачивание эпителия, экструзию клеток, расслоение и заживление ран 3,4,5,6,7 . Активация миозина требует фосфорилирования его регуляторной легкой цепи. Эта модификация ослабляет ингибирующую конформацию молекул миозина, позволяя им образовывать биполярные пучки миозиновых филаментов с несколькими головными доменами на обоих концах. Биполярные миозиновые филаменты управляют антипараллельным движением актиновых филаментов и приводят к генерации сократительной силы ^1,8,9.

Эволюционно консервативная малая ГТФаза семейства Rho RhoA (Rho1 у дрозофилы) играет центральную роль в активации сократительной способности актомиозина в различных клеточных контекстах^10,11. Rho1 функционирует как бимолекулярный переключатель, связывая либо GTP (активная форма), либо GDP (неактивная форма)¹². Цикл между ГТФ- или ГДФ-связанным Rho1 регулируется его ГТФаза-активирующими белками (GAP) и гуаниновыми нуклеотидными факторами обмена (ГЭФ)¹³. ГЭФ функционируют для облегчения обмена ВВП на ГТП и, таким образом, активизируют деятельность Rho1. GAPs, с другой стороны, усиливают активность ГТФазы Rho1 и, таким образом, деактивируют Rho1. Активированный Rho1 способствует сократительной способности актомиозина, взаимодействуя и активируя его нижележащие эффекторы, Rho-ассоциированную киназу (Rok) и Diaphanous¹⁴. Rok индуцирует активацию миозина и сократительную способность актомиозина путем фосфорилирования регуляторной легкой цепи миозина¹⁵. Кроме того, Rok также ингибирует миозин-регуляторную фосфатазу легкой цепи и, следовательно, способствует дальнейшей сборке миозиновых филаментов¹⁶. Rok также может фосфорилировать киназы LIM, которые при активации предотвращают распад актина путем фосфорилирования и ингибирования фактора деполимеризации актина^{кофилина 17,18}. Diaphanous – это актиновый нуклеатор семейства форминов, который способствует полимеризации актина, обеспечивая основу для взаимодействия миозина с 19,20,21.

В то время как клеточные механизмы, активирующие сократительную способность актомиозина, хорошо изучены, наше понимание его функции в регуляции динамического ремоделирования тканей остается неполным. Чтобы восполнить этот пробел в знаниях, требуются подходы, которые могут быстро инактивировать актомиозин в определенных участках тканей in vivo и регистрировать непосредственное влияние на поведение и свойства тканей. В данном протоколе описано использование оптогенетического подхода для резкого ингибирования сократительной способности актомиозина при инвагинации мезодермы дрозофилы с последующим измерением натяжения эпителия с помощью лазерной абляции. Во время гаструляции дрозофилы вентрально локализованные клетки-предшественники мезодермы подвергаются апикальному сужению и инвагинируются с поверхности эмбриона, образуя передне-заднюю ориентированную борозду^22,23. Образование вентральных борозд издавна использовалось в качестве модели для изучения механизма складчатости эпителия. Формирование вентральной борозды осуществляется дорсально-вентральной системой паттерна у дрозофилы^24,25,26,27. Экспрессия двух транскрипционных факторов, Twist и Snail, расположенных на вентральной стороне эмбриона, контролирует формирование вентральной борозды и определяет судьбу мезодермальных клеток²⁸. Twist и Snail активируют рекрутирование Rho1 GEF RhoGEF2 к вершине клеток-предшественников мезодермы через рецепторный путь, связанный с G-белком, и адапторный белок RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. Затем RhoGEF2 активирует миозин по всей апикальной поверхности потенциальной мезодермы через путь Rho-Rho киназы 34,35,36,37,38,39. Активированный миозин образует надклеточную актомиозиновую сеть по всей апикальной поверхности зачатка мезодермы, сокращения которой приводят к сужению апикальной ткани и приводят к быстрому увеличению натяжения апикальной ткани 14,37,40.

Оптогенетический инструмент, описанный в этом протоколе, Opto-Rho1DN, ингибирует сократительную способность актомиозина через зависимую от синего света рекрутацию плазматической мембраной доминантной отрицательной формы Rho1 (Rho1DN)⁴¹. Мутация T19N в Rho1DN устраняет способность мутантного белка обменивать GDP на GTP и, таким образом, делает белок^{вечно неактивным}. Последующая мутация в Rho1DN, C189Y, устраняет его наивный сигнал нацеливания на мембрану^42,43. Когда Rho1DN вводится в плазматическую мембрану, он связывается с Rho1 GEF и захватывает их, тем самым блокируя активацию Rho1, а также Rho1-опосредованную активацию миозина и актина^34,44. Рекрутирование Rho1DN плазматической мембраной достигается с помощью светозависимого модуля димеризации, полученного из Cryptochrome 2 и его связывающего партнера CIB1. Криптохром 2 представляет собой фоторецептор криптохрома, активируемый синим светом, у Arabidopsis thaliana⁴⁵. Криптохром 2 связывается с CIB1, основным белком спирали-петля-спираль, только в его фотовозбужденном состоянии⁴⁵. Позже было обнаружено, что консервативная N-концевая область гомологии фотолиазы (PHR) из криптохрома 2 (CRY2_PHR, далее именуемая CRY2) и N-концевой домен (aa 1-170) CIB1 (далее CIBN) важны для светоиндуцированной димеризации⁴⁶. Opto-Rho1DN содержит два компонента. Первым компонентом является белок CIBN, слитый с якорем CAAX, который локализует белок на плазматической мембране⁴⁷. Второй компонент — CRY2 с мечением mCherry, сплавленный с Rho1DN⁴¹. При отсутствии синего света CRY2-Rho1DN остается в цитоплазме. При стимуляции синим светом CRY2-Rho1DN воздействует на плазматическую мембрану посредством взаимодействия между мембранозакрепленным CIBN и возбужденным CRY2. Opto-Rho1DN может быть активирован ультрафиолетовым светом A (UVA) и синим светом (400-500 нм, пик активации 450-488 нм) или импульсным лазером 830-980 нм при выполнении двухфотонной стимуляции^41,46,47,48. Таким образом, Opto-Rho1DN стимулируется длинами волн, обычно используемыми для возбуждения GFP (488 нм для однофотонной визуализации и 920 нм для двухфотонной визуализации). В отличие от этого, длины волн, обычно используемые для возбуждения mCherry (561 нм для однофотонной визуализации и 1040 нм для двухфотонной визуализации), не стимулируют оптогенетический модуль и, следовательно, могут быть использованы для предстимуляционной визуализации. Протокол описывает подходы, используемые для минимизации риска нежелательной стимуляции во время манипуляций с образцом.

Лазерная абляция широко используется для обнаружения и измерения напряжения в клетках и тканях⁴⁹. Предыдущие исследования показали, что при надлежащем контроле интенсивности лазера двухфотонная лазерная абляция с использованием фемтосекундного лазера ближнего инфракрасного диапазона может физически повредить некоторые субклеточные структуры (например, кортикальные актомиозиновые сети), не вызывая разрыва плазматической ^{мембраны.} Если ткань находится под напряжением, лазерная абляция интересующей области внутри ткани приводит к немедленной отдаче наружу клеток, прилегающих к абляционной области. Скорость отдачи является функцией величины натяжения и вязкости среды (цитоплазмы), окружающей структуры, подвергающиеся отдаче⁴⁹. Из-за превосходной глубины проникновения лазеров ближнего инфракрасного диапазона и способности достигать хорошо ограниченной фокальной абляции, двухфотонная лазерная абляция особенно полезна для обнаружения натяжения тканей in vivo. Как показано в этом протоколе, этот метод может быть легко комбинирован с опто-Rho1DN-опосредованной инактивацией сократимости актомиозина для исследования прямого влияния Rho1-зависимой клеточной сократимости на механику тканей во время динамического ремоделирования тканей.