JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia do Desenvolvimento

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

Published: April 14, 2023
doi:
10.3791/65314
, ,
1Department of Biological Sciences,Dartmouth College, 2School of Life Sciences,Westlake University, 3Department of Molecular Biology,Princeton University

Summary

התכווצות אקטומיוזין ממלאת תפקיד חשוב במורפוגנזה של תאים ורקמות. עם זאת, זה מאתגר לתפעל התכווצות actomyosin in vivo בחריפות. פרוטוקול זה מתאר מערכת אופטוגנטית המעכבת במהירות את התכווצות האקטומיוזין בתיווך Rho1 בעוברי דרוזופילה , וחושפת את האובדן המיידי של מתח אפיתל לאחר השבתת אקטומיוזין in vivo.

Abstract

כוחות התכווצות הנוצרים על ידי אקטין ומיוזין שאינו שריר II (“התכווצות אקטומיוזין”) הם קריטיים לשינויים מורפולוגיים של תאים ורקמות בסקאלות אורך מרובות, כגון חלוקת תאים, נדידת תאים, קיפול אפיתל ומורפוגנזה מסתעפת. הבנה מעמיקה של תפקיד התכווצות האקטומיוזין במורפוגנזה דורשת גישות המאפשרות השבתה מהירה של אקטומיוזין, דבר שקשה להשיג באמצעות גישות גנטיות או פרמקולוגיות קונבנציונליות. הפרוטוקול המוצג מדגים את השימוש במערכת דימריזציה אופטוגנטית מבוססת CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, כדי לעכב התכווצות אקטומיוזין בעוברי דרוזופילה עם בקרות זמניות ומרחביות מדויקות. במערכת זו, CRY2 מאוחה לצורה השלילית הדומיננטית של Rho1 (Rho1DN), בעוד CIBN מעוגן לקרום הפלזמה. דימריזציה בתיווך אור כחול של CRY2 ו-CIBN גורמת לטרנסלוקציה מהירה של Rho1DN מהציטופלסמה לקרום הפלזמה, שם הוא משבית אקטומיוזין על ידי עיכוב Rho1 אנדוגני. בנוסף, מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לצימוד אי-הפעלה בתיווך Opto-Rho1DN של אקטומיוזין עם אבלציה בלייזר כדי לחקור את תפקידו של אקטומיוזין ביצירת מתח אפיתל במהלך היווצרות תלמים גחונים של דרוזופילה . פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תהליכים מורפולוגיים רבים אחרים הכוללים התכווצות אקטומיוזין בעוברי דרוזופילה עם שינויים מינימליים. בסך הכל, כלי אופטוגנטי זה הוא גישה רבת עוצמה לנתח את הפונקציה של התכווצות אקטומיוזין בשליטה על מכניקת רקמות במהלך עיצוב מחדש דינמי של רקמות.

Introduction

התכווצות אקטומיוזין, כוח ההתכווצות המופעל על ידי מיוזין שאינו שריר II (להלן “מיוזין”) ברשת F-actin, הוא אחד הכוחות החשובים ביותר בשינוי צורת התא ובהנעת מורפוגנזהברמת הרקמה 1,2. לדוגמה, הפעלת התכווצות אקטומיוזין בתחום האפי של תאי האפיתל גורמת להתכווצות אפיקלית, המאפשרת מגוון תהליכים מורפוגנטיים, כולל קיפול אפיתל, שחול תאים, דלמינציה וריפוי פצעים 3,4,5,6,7 . הפעלת מיוזין דורשת זרחן של שרשרת האור הרגולטורית שלו. שינוי זה מקל על הקונפורמציה המעכבת של מולקולות המיוזין, ומאפשר להן ליצור צרורות חוטי מיוזין דו-קוטביים עם תחומי ראש מרובים בשני הקצוות. חוטי המיוזין הדו-קוטביים מניעים את התנועה האנטי-מקבילה של חוטי האקטין ומביאים ליצירת כוח התכווצות 1,8,9.

GTPase RhoA הקטן ממשפחת Rho (Rho1 בדרוזופילה) ממלא תפקיד מרכזי בהפעלת התכווצות אקטומיוזין בהקשרים תאיים שונים10,11. Rho1 מתפקד כמתג דו-מולקולרי על ידי קשירת GTP (צורה פעילה) או GDP (צורה לא פעילה)12. המחזור בין Rho1 הקשור ל-GTP או לתמ”ג מווסת על-ידי חלבונים משפעלי GTPase (GAPs) וגורמי חילוף נוקלאוטידים בגואנין (GEFs)13. GEFs פועלים כדי להקל על חילופי התמ”ג עבור GTP ובכך להפעיל את פעילות Rho1. GAPs, לעומת זאת, משפרים את פעילות GTPase של Rho1 ובכך משביתים את Rho1. Rho1 מופעל מקדם התכווצות אקטומיוזין באמצעות אינטראקציה והפעלה של המשפיעים במורד הזרם, קינאז הקשור ל-Rho (Rok) ו-Diaphanous14. Rok גורם להפעלת מיוזין והתכווצות אקטומיוזין על ידי זרחון שרשרת האור הרגולטורית של מיוזין15. בנוסף, Rok גם מעכב את פוספטאז שרשרת האור הרגולטורית מיוזין, ולכן מקדם עוד יותר הרכבת חוט מיוזין16. Rok יכול גם phosphorylate LIM kinases, אשר, כאשר מופעל, למנוע פירוק אקטין על ידי phosphorylating ועיכוב גורם depolymerization actincofilin 17,18. Diaphanous הוא נוקלייטור אקטין ממשפחת הפורמינים המקדם פילמור אקטין ומספק בסיס למיוזין לאינטראקציה עם 19,20,21.

בעוד שהמנגנונים התאיים המפעילים את התכווצות האקטומיוזין הובהרו היטב, הבנתנו את תפקידה בוויסות עיצוב מחדש דינמי של רקמות נותרה חלקית. מילוי פער הידע הזה דורש גישות שיכולות להשבית במהירות אקטומיוזין באזורי רקמה ספציפיים in vivo ולתעד את ההשפעה המיידית על התנהגות הרקמה ותכונותיה. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בגישה אופטוגנטית כדי לעכב בחריפות את התכווצות האקטומיוזין במהלך פלישת דרוזופילה מזודרם, ולאחר מכן מדידת מתח אפיתל באמצעות אבלציה בלייזר. במהלך גסטרולציה של דרוזופילה, תאי מבשר המזודרם הממוקמים בגחון עוברים התכווצות אפית ופולשים מפני השטח של העובר על ידי יצירת תלם קדמי-אחורי22,23. היווצרות תלמים גחונים כבר זמן רב משמש מודל לחקר מנגנון קיפול אפיתל. היווצרות התלם הגחוני מנוהלת על ידי מערכת הדפוס הגבית-גחונית בדרוזופילה24,25,26,27. הביטוי של שני גורמי שעתוק, פיתול וחלזון, הממוקם בצד הגחוני של העובר, שולט בהיווצרות התלם הגחוני ומציין את גורל התא המזודרמלי28. Twist ו-Snail מפעילים את הגיוס של Rho1 GEF RhoGEF2 לקודקוד של תאי קודמן מזודרם באמצעות מסלול קולטן מצומד לחלבון G וחלבון מתאם RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. לאחר מכן, RhoGEF2 מפעיל מיוזין בכל פני השטח האפיקליים של המזודרם הפוטנציאלי דרך מסלול Rho-Rho קינאז 34,35,36,37,38,39. מיוזין מופעל יוצר רשת אקטומיוזין על-תאית לאורך פני השטח האפי של המזודרם פרימורדיום, שהתכווצויותיה מניעות התכווצות אפית וגורמות לעלייה מהירה במתח הרקמה האפיקלית 14,37,40.

הכלי האופטוגנטי המתואר בפרוטוקול זה, Opto-Rho1DN, מעכב התכווצות אקטומיוזין באמצעות גיוס קרום פלזמה תלוי אור כחול של צורה שלילית דומיננטית של Rho1 (Rho1DN)41. מוטציה ב-T19N ב-Rho1DN מבטלת את יכולתו של החלבון המוטנטי להחליף תמ”ג ב-GTP ובכך הופכת את החלבון ללא פעיל באופן תמידי34. מוטציה עוקבת ב-Rho1DN, C189Y, מבטלת את אות המיקוד הנאיבי של הממברנה 42,43. כאשר Rho1DN מוחדר לקרום הפלזמה, הוא נקשר ל-Rho1 GEFs ומטיל אותו, ובכך חוסם את ההפעלה של Rho1 וכן את ההפעלה בתיווך Rho1 של מיוזין ואקטין34,44. גיוס קרום הפלזמה של Rho1DN מושג באמצעות מודול דימריזציה תלוי אור הנגזר מקריפטוכרום 2 ושותפו הקושר CIB1. Cryptochrome 2 הוא פוטורצפטור Cryptochrome מופעל אור כחול ב Arabidopsis thaliana45. קריפטוכרום 2 נקשר ל-CIB1, חלבון סליל-לולאה-סליל בסיסי, רק במצבו המעורר לאור45. מאוחר יותר נמצא כי אזור הומולוגיה N-terminal, photolyase (PHR), מקריפטוכרום 2 (CRY2PHR, להלן CRY2) ותחום N-terminal (aa 1-170) של CIB1 (להלן CIBN) חשובים לדימריזציה הנגרמת על ידי אור46. Opto-Rho1DN מכיל שני רכיבים. המרכיב הראשון הוא חלבון CIBN המאוחה עם עוגן CAAX, אשר ממקם את החלבון לקרום פלזמה47. הרכיב השני הוא mCherry-tagged CRY2 המשולב עם Rho1DN41. בהיעדר אור כחול, CRY2-Rho1DN נשאר בציטופלסמה. לאחר גירוי אור כחול, CRY2-Rho1DN מכוון לקרום הפלזמה באמצעות אינטראקציה בין CIBN מעוגן קרום ו- CRY2 נרגש. Opto-Rho1DN יכול להיות מופעל על ידי אור אולטרה סגול A (UVA) ואור כחול (400-500 ננומטר, הפעלת שיא ב 450-488 ננומטר), או על ידי לייזר פועם 830-980 ננומטר בעת ביצוע גירוי שני פוטונים41,46,47,48. לכן, Opto-Rho1DN מגורה על ידי אורכי גל המשמשים בדרך כלל עבור GFP מרגש (488 ננומטר עבור דימות פוטון בודד ו 920 ננומטר עבור דימות שני פוטונים). לעומת זאת, אורכי גל המשמשים בדרך כלל לדימות mCherry מרגש (561 ננומטר לדימות פוטון בודד ו-1,040 ננומטר לדימות שני פוטונים) אינם מעוררים את המודול האופטוגנטי ולכן ניתן להשתמש בהם לדימות טרום גירוי. הפרוטוקול מתאר את הגישות המשמשות למזעור הסיכון לגירוי לא רצוי במהלך מניפולציה של דגימה.

אבלציה בלייזר שימשה באופן נרחב כדי לזהות ולמדוד מתח בתאים וברקמות49. מחקרים קודמים הראו כי, כאשר עוצמת הלייזר נשלטת כראוי, אבלציה לייזר של שני פוטונים באמצעות לייזר פמטו-שנייה קרוב לאינפרא-אדום יכולה לפגוע פיזית בכמה מבנים תת-תאיים (למשל, רשתות אקטומיוזין בקליפת המוח) מבלי לגרום להתפרצות קרום פלזמה50,51. אם הרקמה נמצאת תחת מתח, אבלציה בלייזר של אזור עניין בתוך הרקמה גורמת לרתיעה מיידית כלפי חוץ של התאים הסמוכים לאזור האבלאט. מהירות הרתיעה היא פונקציה של עוצמת המתח והצמיגות של המדיה (ציטופלסמה) המקיפה את המבנים העוברים רתיעה49. בגלל עומק החדירה המעולה של לייזרים אינפרא אדום קרוב והיכולת להשיג אבלציה מוקדית מוגבלת היטב, אבלציה לייזר של שני פוטונים שימושית במיוחד לגילוי מתח רקמות in vivo. כפי שהודגם בפרוטוקול זה, ניתן לשלב שיטה זו בקלות עם אי-הפעלה בתיווך Opto-Rho1DN של התכווצות אקטומיוזין כדי לחקור את ההשפעה הישירה של התכווצות תאית תלוית Rho1 על מכניקת הרקמה במהלך עיצוב מחדש דינמי של רקמות.

Protocol

1. הגדרת הצלב הגנטי והכנת איסוף הביציות נקבות זבובים נבחרות (בתולות) מהקו האופטוגנטי UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) על כרית CO2 תחת סטריאומיקרוסקופ והציב צלב עם זבובים זכרים מקו הנהג האימהי GAL4 67 Sqh-mCherry; 15 E-cadherin-GFP.הערה: 67 ו-15 מייצגים טובולין-GAL4 אימהי המוכנס לכרומוזומים השני (I…

Representative Results

בעוברים לא מגורים שעברו כיווץ אפיקלי, Sqh-mCherry הועשר באזור הבינוני של התאים המזודרמליים הגחונים, בעוד ש-CRY2-Rho1DN-mCherry היה ציטוסולי (איור 1A). אבלציה בלייזר בתחום ההתכווצות הובילה לרתיעה מהירה של רקמות לאורך ציר A-P (איור 1B,C). בעוברים המגורים, האות CRY2-Rho1DN-mCher…

Discussion

פרוטוקול זה תיאר את השימוש המשולב באופטוגנטיקה ובאבלציה בלייזר כדי לבחון שינויים במתח הרקמה מיד לאחר השבתת התכווצות האקטומיוזין. הכלי האופטוגנטי המתואר כאן מנצל את הצורה השלילית הדומיננטית של Rho1 (Rho1DN) כדי לעכב בחריפות את התכווצות האקטומיוזין האנדוגנית Rho1 והתלויה ב-Rho1. אפיון קודם של Opto-Rho1…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לאן לבנוויי על תמיכתה בהדמיה. המחברים מודים למעבדת וישאוס ולמעבדת דה רנזיס על שיתוף ריאגנטים ולמרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה למניות זבובים. מחקר זה נתמך על ידי NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 ומענק מחקר מוסדי של האגודה האמריקאית לסרטן #IRG-82-003-33 ל- BH.

Materials

35 mm glass-bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid Falcon 351007 Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope Online NA Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite) VWR 10028-048 Used for embryo dechorination
CO2 pad Genesee Scientific 59-114 Used for cross set-up
ddH2O NA NA Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers VWR 102091-654 Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2) VWR 22940-834 Used for sample preparation
FluoView (Software) Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27 Sigma Aldrich H8773-100ML Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI NIH NA Used for image analysis
MATLAB MathWorks NA Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope Nikon NA Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light. Olympus NA Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer) VWR 30621-392 Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield) Bolioptics FM14036151 Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights Amazon NA Used to avoid unwanted light stimulation
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  2. Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
  3. Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. Biologia do Desenvolvimento. 341 (1), 5-19 (2010).
  4. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  5. Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
  6. Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
  7. Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
  8. Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
  9. Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
  10. Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
  11. Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
  12. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  13. Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
  14. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  15. Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
  16. Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
  17. Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
  18. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  19. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  20. Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
  21. Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
  22. Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
  23. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  24. Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
  25. Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. Genética. 214 (3), 543-560 (2020).
  26. Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
  27. Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -. A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629 (2020).
  28. Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
  29. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  30. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  31. Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
  32. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
  33. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  34. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  35. Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  36. Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
  37. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
  38. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  39. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  40. Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
  41. Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082 (2022).
  42. Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
  43. Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
  44. Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
  45. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  46. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  47. Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
  48. Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366 (2018).
  49. Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  50. Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
  51. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  52. Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
  53. Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
  54. Munjal, A., Philippe, J. -. M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
  55. Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
  56. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  57. Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
  58. Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893 (2020).
  59. Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).

Tags

OptogeneticsActomyosin ContractilityEpithelial TensionDrosophila EmbryosLaser AblationMechanical ForcesCell MechanicsCell Sheet FoldingApical Constriction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (194), e65314, doi:10.3791/65314 (2023).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image