JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Varkensmodel van biofilminfectie en onzichtbare wonden

Published: June 16, 2023
doi:
10.3791/65301
, , , , , ,
1Indiana Center for Regenerative Medicine & Engineering, Indiana University Health Comprehensive Wound Center, Department of Surgery,Indiana University School of Medicine

Summary

Chronische wonden die resistent zijn tegen antibiotica vormen een grote bedreiging voor de gezondheidszorg. Biofilminfecties zijn hardnekkig en vijandig en kunnen een gebrekkige functionele wondsluiting veroorzaken. We rapporteren een klinisch relevant varkensmodel van biofilm-geïnfecteerde chronische wonden van volledige dikte. Dit model is zowel krachtig voor mechanistische studies als voor het testen van interventies.

Abstract

Biofilminfectie levert een belangrijke bijdrage aan de chroniciteit van wonden. Het tot stand brengen van klinisch relevante experimentele wondbiofilminfectie vereist de betrokkenheid van het immuunsysteem van de gastheer. Iteratieve veranderingen in de gastheer en ziekteverwekker tijdens de vorming van dergelijke klinisch relevante biofilm kunnen alleen in vivo optreden. Het varkenswondmodel staat bekend om zijn voordelen als een krachtig preklinisch model. Er zijn verschillende gerapporteerde benaderingen voor het bestuderen van wondbiofilms. In vitro pt ex vivo systemen zijn gebrekkig wat betreft de immuunrespons van de gastheer. Kortdurende in vivo studies omvatten acute responsen en laten dus geen biofilmrijping toe, zoals bekend klinisch gebeurt. In 2014 werd voor het eerst een langetermijnonderzoek naar de biofilm van varkenswonden gerapporteerd. De studie erkende dat met biofilm geïnfecteerde wonden kunnen sluiten zoals bepaald door planimetrie, maar dat de huidbarrièrefunctie van de aangetaste plaats mogelijk niet wordt hersteld. Later werd deze observatie klinisch gevalideerd. Zo werd het concept van functionele wondsluiting geboren. Wonden die gesloten zijn maar een tekort hebben aan huidbarrièrefunctie kunnen worden gezien als onzichtbare wonden. In dit werk proberen we de methodologische details te rapporteren die nodig zijn om het langetermijnmodel van biofilm-geïnfecteerde ernstige brandwonden te reproduceren, dat klinisch relevant is en translationele waarde heeft. Dit protocol biedt gedetailleerde richtlijnen voor het vaststellen van een 8 weken durende wondbiofilminfectie met behulp van P. aeruginosa (PA01). Acht brandwonden van volledige dikte werden symmetrisch gemaakt op het dorsum van gedomesticeerde witte varkens, die op dag 3 na de verbranding werden ingeënt met (PA01); vervolgens werden niet-invasieve beoordelingen van de wondgenezing op verschillende tijdstippen uitgevoerd met behulp van laserspikkelbeeldvorming (LSI), echografie met hoge resolutie (HUSD) en transepidermaal waterverlies (TEWL). De ingeënte brandwonden werden afgedekt met een vierlaags verband. Biofilms, zoals vastgesteld en structureel bevestigd door SEM op dag 7 na inoculatie, brachten de functionele wondsluiting in gevaar. Een dergelijke nadelige uitkomst kan worden omgedraaid als reactie op passende interventies.

Introduction

Biofilminfectie compliceert brandwonden en chronische wonden en veroorzaakt chroniciteit 1,2,3,4,5. In de microbiologie worden voornamelijk biofilmmechanismen bestudeerd, met een focus op de microben 1,6. De lessen die uit deze studies zijn getrokken, zijn van het grootste belang vanuit biologisch wetenschappelijk oogpunt, maar zijn niet noodzakelijkerwijs van toepassing op klinisch relevante pathogene biofilms 6,7,8. Klinisch relevante structurele aggregaten van biofilm moeten zowel microbiële als gastheerfactorenbevatten 8,9,10. Een dergelijke micro-omgeving maakt het mogelijk om iteratieve interacties tussen gastheer en microbe op te nemen, die van cruciaal belang zijn voor de ontwikkeling van een klinisch relevante biofilm 7,8. In een dergelijk proces is de deelname van immuuncellen en door bloed overgedragen factoren van cruciaal belang11,12. De interacties tussen gastheer en microbe die ten grondslag liggen aan klinisch pathogene biofilms, zoals te zien is bij chronische wonden, treden op over een lange periode. Elke experimentele benadering die gericht is op het ontwikkelen van een translationeel relevant model van biofilminfectie moet dus rekening houden met deze factoren. Daarom wilden we een klinisch reproduceerbaar model voor chronische biofilminfecties bij varkens ontwikkelen.

Hoewel studies bij mensen duidelijk de beste benadering zijn voor het bestuderen van genezingsresultaten, zijn ze vaak niet het meest geschikt om de onderliggende mechanismen en nieuwe mechanistische paradigma’s aan te pakken. Ethische bezwaren beperken het gebruik van onderzoeksontwerpen die het verzamelen van meerdere biopsieën van een chronische wond op verschillende tijdstippen vereisen. Het is daarom van cruciaal belang om een goed ingeburgerd en reproduceerbaar diermodel te hebben om invasieve studies mogelijk te maken voor een grondig onderzoek van het lot van biofilm 7,13. De keuze van een diermodel hangt af van verschillende factoren, waaronder wetenschappelijke/translationele relevantie en logistiek. Het varkenssysteem wordt algemeen erkend als het meest translationeel waardevolle experimentele model om menselijke huidwonden te bestuderen7. Dit werk rapporteert dus een gevestigd varkensmodel van biofilm-geïnfecteerde brandwonden over de volledige dikte. Dit werk is gebaseerd op verschillende originele publicaties die in de literatuurzijn vermeld 2,7,13,14,15,16,17. In deze studie werd gekozen voor een klinisch isolaat van multiresistente Pseudomonas aeruginosa (PA01) om de wond te infecteren. P. aeruginosa is een veel voorkomende oorzaak van wondinfecties 2,18,19,20. Het is een Gram-negatieve bacterie die moeilijk te behandelen kan zijn vanwege zijn resistentie tegen sommige antibiotica11,19,21. Geen van de tot nu toe gerapporteerde biofilmmodellen voor varkens betrof langetermijnstudies van 8 weken 22,23,24,25,26. Chronische wonden zijn wonden die 4 weken of langer open blijven 14,27,28. Er zijn geen andere chronische wondbiofilmmodellen gerapporteerd in de literatuur. Dit werk richt zich op de notie van functionele wondsluiting 2,7,13,15,17,29.

Protocol

Alle dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) #21147. De studie werd uitgevoerd in het Laboratory Animal Resource Center (LARC), Indiana University. We gebruikten een vrouwelijk gedomesticeerd wit varken (70-80 lb) in dit protocol. 1. Acclimatisatie van dieren Bij aankomst van de varkens in de faciliteit, huisvest de dieren individueel in dezelfde ruimte gedurende ten minste 3 dagen voor acclimatisatie en sociale interactie. Geef de varkens een uitgebalanceerd dieet. Bepaal de hoeveelheid die wordt gevoerd op basis van het gewicht en volg de aanbevelingen van de fabrikant. Zorg ervoor dat het dier 6-12 uur voorafgaand aan de procedure nuchter is om misselijkheid, braken en het opzuigen van maagvocht onder narcose te voorkomen. 2. Opstelling van de operatiekamer Bereid het anesthesieapparaat voor en zorg ervoor dat het klaar is met het rebreathing-circuit. Richt de operatiekamer in zoals hieronder beschreven (Figuur 1A).Bedek de proceduretafel met een steriel laken en plaats er een circulerende waterdeken onder om te helpen bij de thermoregulatie. Zet een tafel op met inductiebenodigdheden en materiaal voor de voorbereiding van operaties. Zet een tafel neer met de branderapparaten en schakelkasten. Stel de beeldvormingsapparatuur in en zorg ervoor dat deze is ingeschakeld. 3. Sedatie van het varken Verdedig het varken met een intramusculaire injectie van TKX (Telazol 4,4 mg/kg; ketamine 2,2 mg/kg; xylazine 2,2 mg/kg) in een dosis van 1 ml/50 lb. Houd het varken in de behandelkamer op 1%-3% isofluraan toegediend via een masker. De (preoperatieve) pijnstillers toedienen aan de varkens volgens het IACUC-protocol; enkele voorbeelden zijn als volgt: buprenorfine 0,3 mg/ml, 0,01-0,05 mg/kg IM; carprofen 50 mg/ml, 4 mg/kg IM of SQ; fentanyl transdermaal 100 mcg/h geplaatst op de oorschelp; gabapentine 300 mg capsules, 3-10 mg/kg oraal.OPMERKING: Voor alle brandwonden- en biopsieprocedures wordt 1 dosis gabapentine gegeven op de dag voorafgaand aan de operatie en 1 dosis carprofen op de dag van de procedure. Voor de hoofdverbrandingsprocedure wordt een fentanylpleister geplaatst en wordt 1 volledige dosis buprenorfine gegeven tijdens de chirurgische voorbereiding. 4. Inductie van anesthesie Steriliseer het oor minstens drie keer met afwisselend 2% chloorhexidinescrub en alcohol. Breng A 22-18 G 1 in een intraveneuze katheter in de marginale oorader in en bevestig de bloedstroom. Spoel de katheter door met zoutoplossing en bevestig de katheter met chirurgische tape (Figuur 1B). Intubeer het varken met een endotracheale tube van de juiste grootte (7-9 mm) zodra spierontspanning is bereikt door inhalatie van anesthesie via het masker. Controleer de spierontspanning door een verlies van kaaktonus en een ooglidreflex die wordt waargenomen.Open de tube en test het lek van de manchet met een spuit met lucht. Breng de buis in met behulp van een laryngoscoop30. Blaas de manchet op en zet de buis vast zodra de juiste plaatsing is bevestigd. Sluit het varken aan op het rebreathing-circuit.NOTITIE: De buis wordt over de snuit vastgebonden en rolgaas wordt gebruikt om deze vast te zetten. Auscultatie van de borstkas wordt uitgevoerd met een stethoscoop om de juiste plaatsing van de buis te bevestigen.NOTITIE: Tijdens anesthesie wordt elke 5-10 minuten lucht toegevoerd door het pop-off-ventiel te sluiten en de beademingszak in te drukken totdat de drukmanometer 20 mm/Hg bereikt om positionele atelectase te voorkomen. Houd het dier en de diepte van de anesthesie in de gaten.Sluit het varken aan op een multiparametermonitor. De monitor leest continu de zuurstofverzadiging (SpO 2), hartslag, eindgetijdenkooldioxide (EtCO2), ademhalingsfrequentie en temperatuur. Noteer de vitale functies elke 10 minuten tijdens de procedure. Beoordeel de diepte van de anesthesie door de pijnreflexen te testen met een teenknijp in het achterbeen voordat u met de verwonding begint.NOTITIE: Pas indien nodig de verdovingsverdamper aan om extra anesthesie toe te dienen, of wacht een paar minuten. Controleer tijdens de operatie regelmatig de pijnreflexen en ooglidreflexen. 5. Dierlijk preparaat voor brandwonden Koppel het varken los van het anesthesieapparaat en verplaats het naar de operatietafel. Plaats het varken in de sternale ligpositie en zorg ervoor dat u alle aangesloten lijnen en buizen vastzet (Figuur 1C). Sluit het varken weer aan op het anesthesieapparaat en houd de O2 op 0,8-1,5 l/min en de isofluraan op 1%-3% tot het einde van de procedure. Dien IV-vloeistoffen (LRS) toe aan het varken met een druppelsnelheid van 8-10 ml/kg/uur. Controleer de anesthesie zoals in stap 4.3. 6. Antiseptische voorbereiding en markering van de brandwond op de huid Bereid het wondgebied voor door te scheren en de ontharingscrème aan te brengen, zoals hieronder beschreven (Figuur 2).Scheer het rugvlies van het varken in een gebied van ongeveer 25 cm breedte van de wervelkolom tot aan de oksel aan beide zijden met behulp van een elektrische tondeuse. Breng de ontharingscrème aan op het geknipte gebied en laat 3-7 minuten intrekken. Verwijder de crème samen met het haar met schone absorberende handdoeken. Voorbereiding van de brandplaatsSchrob het te verwonden gebied minstens drie keer gedurende ongeveer 5 minuten met afwisselend 2% chloorhexidinescrub en 70% isopropylalcohol. Zorg ervoor dat de scrub in een rooskleurig patroon wordt aangebracht (beginnend in het midden en naar buiten bewegend in een spiraal) door personeel dat steriele handschoenen draagt. Markeer de wondplaatsen met behulp van een steriel brandwondensjabloon en een chirurgische huidmarker (Figuur 2B). Markeer zes tot acht wonden (2 inch x 2 inch) symmetrisch op het rugspek. Bedek de gebieden rond de gemarkeerde locaties met een steriel laken om besmetting te verminderen (Figuur 2C). 7. Procedure voor brandwonden Gebruik een brandapparaat, zoals een in eigen huis vervaardigde aangepaste brander bestaande uit een roestvrijstalen blok van 2 x 2 inch (gewicht: 352 g) dat is aangesloten op een metalen stylus, een elektronische microstaat en een elektronische weegschaal (totaal gewicht: 1,714 g; Figuur 3).Stel de brander in op de gewenste temperatuur. Stel de doeltemperatuur voor wonden over de volledige dikte in op 150 °C (Figuur 3A). Stel hiervoor het instelpunt (SP) op de besturingseenheid in op 150 °C. Stel het lage instelpunt in op 145 °C en het hoge instelpunt op 155 °C (Figuur 1D). Creëer een brandwond over de volledige dikte van 2 inch x 2 inch door verwarmde roestvrijstalen blokken te gebruiken die zijn aangesloten op het brandwondenapparaat en deze gedurende 60 s op de huid te plaatsen (Figuur 3B, C). Gebruik tijdens het aanbrengen van de verbranding de elektronische weegschaal om ervoor te zorgen dat er een gelijkmatige druk wordt uitgeoefend door de brander. 8. Beoordeling en beeldvorming van brandwonden Digitale fotografieBreng de wonden in beeld met behulp van een DSLR-camera en een elektrofocus korte backfocus (EFS) 17-55 mm ultrasone groothoeklens en een zaklamp. Maak een digitale foto van de rug van het hele varken, inclusief een plakkaat met de identificatie van het varken, het tijdstip en de datum. Maak vervolgens foto’s voor elke wond afzonderlijk, met een plakkaat met de varkens-ID, wond-ID en tijdstip, en een liniaal. Bereken het wondgebied als het percentage van de oorspronkelijke wondgrootte op elk tijdstip van afname tot dag 56.OPMERKING: In dit werk werd het wondgebied op elk tijdstip (d0, d7, d14, d28 en d56) berekend als een percentage van het oorspronkelijke wondgebied op d0. Laser spikkel beeldvorming (LSI)Gebruik voor laserbeeldvorming van spikkels een bloedperfusiebeeldcamera op basis van de laserspikkelcontrastanalyse (LASCA)-technologie om de microvasculaire perfusie van de wond in realtime te beoordelen. Maak de beelden van alle wonden in één opname. Pas de gemeten waarde van de werkafstand van de lasercamera tot de wond zo aan dat deze consistent is voor de beeldvorming van elke wond (Figuur 4A). Leg de perfusie vast aan de hand van een reeks beelden die over een periode van 10-15 s zijn gemaakt. Nadat een wond in beeld is gebracht, wordt de opname automatisch gepauzeerd en wordt de opname hervat zodra de camera is aangepast aan de volgende wond. Elke keer dat de opname wordt gepauzeerd, wordt een marker toegevoegd om de wond te identificeren. Transepidermaal waterverlies (TEWL)Meet de TEWL voor elke wond met behulp van een standaardapparaat, een TEWL-sonde en software (Figuur 4B). Plaats voor elke wond een schoon sondekapje over de sondepunt, dat in contact komt met het wondweefsel. Plaats de sonde voorzichtig en gelijkmatig op de huid en start de meting door op de Start-knop op het apparaat te drukken. Meet elke wond vijf keer, eerst in het midden en dan op elke hoek. Exporteer vervolgens alle metingen naar een spreadsheet (Figuur 4B). Harmonische echografie (HUSD)Voer HUSD-mapping uit door de wond te scannen met een ultrasone (US) sonde vanaf de middellijn (wervelkolom) vanaf de normale huid naar de laterale kant van het varken waar weer normale huid is. Volg dit scanpatroon voor elke wond in zowel B-modus als weefselelastografiemodus met behulp van het echografieapparaat (Figuur 4C).Breng voor scannen in de B-modus steriele ultrasone gel aan op het wondgebied en breng wat aan op de ML-615 sonde met hoge resolutie. Annoteer elke opname met het wondidentificatielabel. Start de opname en beweeg de sonde langzaam vanaf de middellijn langs de wond totdat de normale huid aan de andere kant is bereikt.OPMERKING: Na het voltooien van het scannen wordt de opname opgeslagen en geëxporteerd vanaf het apparaat voor analyse. Voor elastografie zet u het echografieapparaat in de elastomodus door op de Elasto-knop te drukken. Scan de wond opnieuw op dezelfde manier als bij het scannen in de B-modus, waarbij u ervoor zorgt dat de uniforme druk van de sonde wordt gehandhaafd, zodat de elastografiekleurindicator (groene balken) gedurende de hele opname zichtbaar blijft.NOTITIE: De juiste druk kan worden bepaald door de schaalbalk op de opname, die groen wordt weergegeven wanneer het juiste contact wordt gemaakt (Figuur 4D). Wijzig de annotatie nadat elke wond is afgebeeld in zowel B-modus als elasto-modus (twee opnames per wond). Wijzig de opmerking in de software om de informatie voor de volgende wond op te nemen en herhaal het proces voor de volgende wonden. 9. Zwachtelen en aankleden Bedek de brandwonden afzonderlijk met transparante filmverbanden of het testverband (Figuur 5A, B). Plaats een groter transparant filmverband over het hele wondgebied (Figuur 5C). Breng een tweede laag rolgaas losjes aan rond de hele romp van het varken om eventueel vloeibaar exsudaat dat uit de wonden komt te absorberen. Rol het varken heen en weer van zijn zij naar iets op zijn rug om het verbandmateriaal om het varken te wikkelen. Bedek het gaas losjes met een laag flexibel elastisch verband (Figuur 5D). Zorg ervoor dat het verband niet te strak zit, want als u het te strak aanbrengt, kan dit de ademhaling beperken en druk uitoefenen op de buik, wat kan leiden tot rectale verzakking of verschillende complicaties.NOTITIE: Het elastische verband is rekbaar en kan tijdens het aanbrengen gemakkelijk te strak worden aangetrokken. Door het van de rol te trekken en het over de rand van de vorige wikkel te laten liggen, kunt u voorkomen dat het te strak wordt aangedraaid. Bedek het elastische verband met een laatste laag van 4 in elastische tape (Figuur 4E). Nogmaals, zorg ervoor dat de applicatie niet te strak zit, maar zorg ervoor dat het verband aan de boven- en onderkant is vastgezet om te voorkomen dat het naar beneden glijdt als het varken na de procedure beweegt. 10. Herstel van dieren en postoperatieve zorg TerugwinningStop het verdovingsgas na voltooiing van de verwonding, beeldvormingsprocedure en verband. Laat het varken minimaal 5 minuten aan de zuurstof staan. Verplaats het varken, nadat het is teruggekeerd naar de primaire leefruimte, van de transport-/heftafel naar een schuimrubberen terugwinningsmat in de kooi. Breng de automatische waterbak omhoog en verwijder de j-feeder om letsel aan het varken tijdens het herstel te voorkomen. Bedek het varken met dekens (inclusief een heteluchtdeken) als er sprake is van onderkoeling. Bewaak en registreer de vitale functies, inclusief de temperatuur, hartslag, ademhalingsfrequentie en SpO2 elke 10-15 minuten. Houd het varken continu in de gaten totdat het in staat is om zelfstandig sternale ligging te behouden. Zodra het varken volledig hersteld is, laat u het tepelwater zakken en kan het varken ook worden gevoerd. Pijnlijk onderzoekVoer een postoperatieve pijnbeoordeling uit met behulp van een aangepast Glasgow-pijnscoreformulier. Zorg ervoor dat de pijnbeoordelingen gedurende de eerste 3-4 dagen na de operatie ten minste elke 12 uur worden ingevuld door laboratorium- of LARC-personeel. De frequentie van het scoren van pijn wordt bepaald door de behandelend dierenarts. Als het dier hoger scoort dan 5, dien dan reddingsanalgesie (buprenorfine of hydromorfon) toe. Zorg voor analgesie door toediening van een dosis buprenorfine 0,01-0,05 mg/kg IM vóór de procedure, met een tweede dosis 8-12 uur later. Plaats een fentanylpleister (100 mcg/u) op de oorschelp voorafgaand aan de brandwond. Injecteer carprofen 4 mg/kg IM of SQ vóór de procedure, en vervolgens eenmaal daags IM, SQ of PO gedurende 2 dagen of zoals voorgeschreven door de LARC-dierenarts. Geef gabapentine 3-10 mg/kg oraal, met een dosis die wordt gegeven op de dag voorafgaand aan de procedure, de ochtend van de procedure, de avond na de procedure en vervolgens elke 12 uur gedurende 3-5 dagen. DieetZorg ervoor dat de varkens worden hersteld en geef vervolgens tweemaal daags vrije toegang tot water en voedsel volgens hun op gewicht gebaseerde rantsoen. Zorg voor voedselverrijking (verse groenten en fruit, bevroren fruit, marshmallows, yoghurt, pudding, enz.) en gebruik deze om eten te verleiden als er een verminderde eetlust wordt waargenomen. VerbandwisselVervang het verband minstens één keer per week of vaker als het verband vuil wordt of om behandelingsstrategieën mogelijk te maken. Vervang het verband na beeldvorming terwijl het nog onder narcose is, of verdoof het varken met alleen TKX voor een verbandwissel. Om het verband te vervangen, begint u met het voorzichtig verwijderen van het vuile verband met een Lister-verbandschaar of traumaschaar, waarbij u erop let dat de buitenkant van het verband niet in contact komt met de wonden. Reinig het gebied rond de wonden indien nodig met 0,9% NaCl op schoon gaas en droog het gebied voorzichtig af. Volg de procedurestappen voor het verbinden zoals beschreven in sectie 9.OPMERKING: Als experimentele verbanden worden aangebracht, kunnen deze worden aangebracht voordat de wonden worden afgedekt met het transparante filmverband. Beeldvorming frequentieVerkrijg beeldvorming (digitale foto’s, LSI, TEWL en HUSD) op verschillende tijdstippen tijdens het onderzoek. Verzamel beeldvormingsgegevens op dag −3 (brandwond), dag 0 (inenting) en dag 7, dag 14, dag 28, dag 35 en dag 56 na inenting. 11. Voorbereiding en inoculatie van biofilm Entmateriaal bereidingMaak een startplaat van een glycerol diepvriesbouillon van Pseudomonas aeruginosa (PA01) voor een zuivere kweek van de bacterie. Kweek een P. aeruginosa-cultuur in zoutarme Luria-Bertani-agar (LBA) en incubeer deze ‘s nachts bij 37 °C. Inoculeer de volgende dag 5 ml zoutarme Luria−Bertani-bouillon (LBB) met een enkele P. aeruginosa-kolonie en incubeer ‘s nachts bij 37 °C met schudden bij 200 tpm. Om logfasecellen te verkrijgen, inoculeert u 200 μl van de nachtelijke cultuur in 5 ml LBB en incubeert u in de shaker bij 200 tpm bij 37 °C gedurende 2,5 uur. Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) met behulp van een spectrofotometer. Bereid seriële verdunningen tot 1 x 10−9 met behulp van 100 μl uit de kweek in 900 μl steriele LBB.OPMERKING: We zijn begonnen met onverdunde monsters en zijn geëindigd met 1 x 10 7 CFU/ml.We hebben telbare kolonies verkregen in de verdunning van 1 x 107, dus we hebben deze verdunning beschouwd als de eindverdunning. Verdeel 100 μL van elke verdunning over LBA en incubeer een nacht bij 37 °C. Gebruik volgens standaard microbiologische protocollen verdunningen met telbare kolonies (30-300) voor het aantal kolonies en verkrijg de kolonievormende eenheden (CFU). Inenting van de wondInoculeer 200 μL van de nachtcultuur in 5 ml LB-bouillon en incubeer gedurende 2,5 uur in de shaker bij 37 °C. Meet de optische dichtheid van de dagcultuur bij 600 nm (OD600). Gebruik voor PA01-inoculatie 3 x 10 8 CFU/ml (250 μL van 1 x 108 CFU/ml PA01 wordt per wond geënt). Vervoer het entmateriaal naar de dierenfaciliteit in een container voor biologisch gevaar. Verdeel het inoculum over het oppervlak van de blootgestelde wonden op dag 3 na verbranding met behulp van een pipet en verdeel het gelijkmatig met behulp van een wegwerpspreider (Figuur 6). Houd de wonden ongeveer 15 minuten open voordat u gaat verbinden.OPMERKING: Alle chirurgische ingrepen, inenting, weefselbiopsieën, beeldvorming en verband worden uitgevoerd onder algemene anesthesie zoals in secties 3 en 4. Bevestiging van de vaststelling van de infectieOPMERKING: Om te bevestigen dat de wonden na de inenting met succes zijn geïnfecteerd, worden verschillende benaderingen gebruikt en worden wondmonsters vergeleken met monsters die van de normale huid zijn verzameld; Hieronder vindt u enkele voorbeelden.Voor de op pathologie gebaseerde analyse van monsters die op verschillende tijdstippen zijn verzameld, gebruikt u het aantal kolonievormende eenheden om een infectie (CFU; Figuur 7E, F).Verzamel 6 mm wondweefsel door middel van ponsbiopsie. Etiketteer en weeg lege buizen van 5 ml met ronde bodem. Breng de monsters over naar de buizen en weeg de buizen met de monsters. Snijd het weefsel in blokjes met een scalpel op een steriel oppervlak. Voer alle stappen uit in een BSL2-kap.OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de weefsels gemakkelijk kunnen worden gehomogeniseerd, moet de grootte zeer klein zijn (maar niet minder dan 0,5 mm) Doe het monster in het buisje en voeg 1 ml PBS toe. Meng en maal het weefsel met behulp van een harde weefselslijpsonde. Serieel verdunnen (onverdund tot 1 x 10−5) het homogenaat en plaat 50 μL van elke verdunning in selectieve (Pseudomonas Isolation Agar, PIA) en niet-selectieve (LBA) media. Incubeer alle verdunningen onder aërobe omstandigheden bij 37 °C gedurende 18-24 uur. Stel de platen voor met de juiste lichtomstandigheden. Selecteer platen met 30-300 kolonies, als geen van de platen die concentratie heeft bereikt, gebruik dan de onverdunde plaat. Gebruik ImageJ om het aantal kolonies te tellen en bereken de kve per plaat door de gemiddelde waarde te vermenigvuldigen met de uiteindelijke verdunningsfactor. Verkrijg de beelden van monsters die zijn verzameld vanaf dag 7 na inoculatie en andere tijdstippen met behulp van scanning-elektronenmicroscopie (SEM) om de aanwezigheid van de bacteriële biofilms te bevestigen (Figuur 7G).OPMERKING: Dag 7 na inenting werd gekozen omdat het de dag is van het ontstaan van biofilminfectie en het begin van verzachting van de brandwondenschil, waardoor de penetratie van de Amerikaanse golven mogelijk is en dus de visualisatie van de diepere weefsels. Bekijk in figuur 4 de afbeelding van de Amerikaanse brandwond van dag 3, die de dikke leerachtige korst laat zien die voorkomt dat de Amerikaanse golven naar de diepere weefsels gaan. Kleur de secties van de wondbiopten met specifieke antilichamen tegen P. aeruginosa om de aanwezigheid van de specifieke bacterie te bevestigen, zoals getoond in een eerdere publicatie13 (Figuur 7H). Voer next-generation sequencing (NGS) uit, zoals gepubliceerd in Sinha et al.31. Kwantificeer de bacterie 16srRNA van de geïnfecteerde wonden en de normale niet-geïnfecteerde huidmonsters die op verschillende tijdstippen zijn verzameld, beginnend op dag 7 na inoculatie tot het einde van het onderzoek. 12. Biopsie collectie Verzamel de weefselbiopten voor analyse na beeldvorming op dag 7, dag 14, dag 28 en dag 56 na inoculatie. Verzamel slechts één keer biopsieën van elke wond om de interferentie met het genezingsproces te minimaliseren.OPMERKING: Alle chirurgische ingrepen, inenting, weefselbiopsieën, beeldvorming en verband worden uitgevoerd onder algemene anesthesie zoals in secties 3 en 4.Infiltreer het gebied rond de wond met 0,5% bupivacaïne. Snijd een strook van 3-4 mm breed van de ene rand van de wond naar de andere, met kleine marges van normale huid aan beide kanten, met behulp van een wegwerpscalpel met een mesje van maat 10. Plaats de strip in een gelabelde conische buis gevuld met 4% gebufferde formaline voor fixatie.OPMERKING: Voor vroege beeldvorming en biopsieprocedures op het tijdstip wordt een volledige dosis buprenorfine gegeven tijdens de chirurgische voorbereiding. Voor biopsieprocedures op een laat tijdstip wordt een halve dosis buprenorfine gegeven tijdens de chirurgische voorbereiding. Na alle brandwonden- en biopsieprocedures krijgt gabapentine gedurende maximaal 7 dagen tweemaal daags toegediend, zoals geadviseerd door de behandelende dierenarts. Carprofen wordt gegeven gedurende dagen na de operatie of zoals geadviseerd door de behandelend dierenarts. Snijd een ponsbiopsie van 6 mm uit de wond (van het wondbed of van de wondrand). Verzamel van de wondrand, inclusief een deel van de normale huid en het wondbed, voor verschillende soorten analyse. Verwijder het monster met een gesteriliseerde pincet en een ontleedschaar. Plaats het biopsiemonster in de juiste buis of cassette voor verwerking en analyse. Bewaar de monsters voor CFU, SEM, RNA en FPPE in buisjes met een geschikte buffer. Monsters kunnen bijvoorbeeld in OCT in cassettes worden geplaatst voor laseropnamemicroscopie (LCM) en immunohistochemie (IHC). Bereik hemostase nadat de monsters zijn verzameld door zachtjes met een steriel gaasje op de wond te drukken. Bedek de wond met een niet-klevend verband en verband zoals in rubriek 9. 13. Euthanasie en weefselafname Verdoof het varken op de dag van euthanasie met TKX en verdoven met isofluraan. Plaats een intraveneuze katheter in de marginale oorader volgens de stappen die in rubriek 3 worden beschreven. Intubeer het varken volgens de stappen in rubriek 4. Verwijder het verband zodra het varken is verdoofd en reinig het gebied rond de wonden. Volledige digitale fotografie, LSI-, TEWL- en HUSD-beeldvorming. Verzamel de monsters van de wonden en de normale huid volgens de stappen die in rubriek 12 worden beschreven. Zodra alle vereiste monsters zijn verzameld, euthanaseert u het varken op humane wijze terwijl het nog onder narcose is via een intraveneuze injectie met in de handel verkrijgbare euthanasieoplossing (natriumpentobarbital). Gebruik een stethoscoop om te ausculteren om het stoppen van de hartslag en spontane ademhaling te bevestigen. Voer een secundaire euthanasiemethode uit, zoals vereist door SOM IACUC, door een scalpel te gebruiken om pneumothorax te induceren. Breng het varkenskarkas over in een vat en transporteer het naar de vriezer om te worden opgehaald voor verbranding.

Representative Results

Een gestandaardiseerd brandwondenapparaat werd gebruikt om brandwonden van volledige dikte te creëren bij 150 °C gedurende 1 minuut, wat resulteerde in een homogene diepe brandwond met een uniforme marge van erytheem en ontsteking (Figuur 3 en Figuur 7). Elk varken kreeg acht brandwonden van volledige dikte op hun rug, zoals afgebeeld in figuur 3C. De niet-invasieve real-time beoordeling van de brandwonden door middel van B-mode echografie met hoge resolutie om de wonddiepte en progressie van wondgenezing in de loop van de tijd te bevestigen, toonde de vernietiging van alle huidlagen tot aan het onderhuidse vet (Figuur 4). Laser speckle imaging (LSI) werd gebruikt voor verdere karakterisering van de wondperfusie (Figuur 4A). De brandwonden vertoonden een dik pyogeen membraan op het wondoppervlak op dag 7 na inoculatie, wat de infectie en de vestiging van de biofilm van de brandwond bevestigde (Figuur 7A). Digitale planimetrie toonde een groter wondgebied op dag 3 na inoculatie met PAO1 als gevolg van de ontstekingsreactie op de wondplaats en marges (Figuur 7A,B). Hoewel het wondgebied op dag 14 na inoculatie begon te krimpen, werd op dag 56 onvolledige genezing waargenomen tot ongeveer 25% van de oorspronkelijke wondgrootte, wat wijst op de chroniciteit van de wonden (Figuur 7B). Chroniciteit van de wond en verminderde wondgenezing werden verder bevestigd door de TEWL, die een hoog transepidermaal waterverlies vertoonde. De TEWL-resultaten weerspiegelden het verlies van de huidbarrièrefunctie in vergelijking met de normale huid op alle tijdstippen, wat wijst op een functionele verslechtering van de genezing van de brandwond (Figuur 7B). Dit werd ook bevestigd door de onderdrukking van de tight junctionele eiwitten ZO-1 en 213 en de verslechtering van het herstel van de huidbarrièrefunctie, zoals weerspiegeld in de hoge TEWL-waarden die werden waargenomen op dag 35 (midden) en dag 56 (laat) ondanks de visuele wondsluiting (Figuur 7I). De branddiepte werd verder gevalideerd door H&E-kleuring, die vervorming en necrose van alle histologische huidlagen vertoonde, zoals weergegeven in figuur 7C. De vastgestelde biofilm van PA01 werd verder gevalideerd op dag 7 na inoculatie door CFU (Figuur 7E,F), SEM-beeldvorming (Figuur 7G) en immunofluorescentiekleuring (Figuur 7H). Figuur 1: Opstelling voor de procedure . (A) Voorbereiding van de operatietafel. (B) Oorveneuze canulatie voor IV-vloeistoffen en toediening van geneesmiddelen. (C) Thermische deken om het varken te beschermen tegen onderkoeling tijdens de procedure. (D) Instelling van de brander en de timer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Sterilisatie en markering op de operatieplaats . (A) Knippen en steriliseren van haar. (B) Markering van de brandwond met behulp van een steriele standaardsjabloon met acht wonden (elke wond is 2 inch x 2 inch). (C) Eindmarkering met behulp van een steriele huidmarker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Inductie van brandwonden. (A,B) Gestandaardiseerde brander met een manometer en geautomatiseerde regeleenheid (2 inch x 2 inch) aangebracht op de vooraf gemarkeerde wondplaats. (C) De hele rug met de acht brandwonden over de volledige dikte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Beeldvorming en beoordeling van niet-invasieve brandwonden. (A) Laserspikkelbeeldvorming (LSI) met de juiste oriëntatie van de laserstraalindicator naar het midden van de wond wordt weergegeven in de afbeelding aan de linkerkant; de afbeelding aan de rechterkant toont het LSI-apparaat en de real-time kaart van de vasculaire perfusie van de huid. (B) Transepidermaal waterverlies (TEWL) sondetoepassing op de wondplaats op vijf verschillende plaatsen (vier wondhoeken en het midden gedemonstreerd in de afbeelding in de rechterbenedenhoek) wordt weergegeven in de afbeelding aan de linkerkant; de afbeelding aan de rechterkant is een representatief real-time vastgelegd scherm van de TEWL-meting. (C) Aan de linkerkant wordt een harmonische echografie van de brandwond gescand met behulp van een ultrasone sonde van 16 MHz met hoge resolutie; De afbeelding aan de rechterkant toont het ultrasone apparaat en de real-time schermopname. (D) Structurele (B-modusbeelden, echografie in grijstinten) en biomechanische (elastografie, kleurenechografie) beelden van de plaats van de brandwond op de inentingsdag en dag 7 na inoculatie. De wonddiepte wordt aangegeven door de gele stippellijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Wondverband en verband . (A) Aanbrengen van het transparante filmverband voor elke wond afzonderlijk. (B) Alle dorsale geënte brandwonden worden bedekt met de eerste laag verband. (C) Een groter transparant filmverband wordt over het hele wondgebied geplaatst. (D) Aanbrengen van de tweede laag gaas en een losse laag rekbaar elastisch verband rond de hele romp van het varken om eventueel vloeibaar exsudaat dat uit de wonden komt te absorberen. (E) Bedekken van het gehele wondgebied met een laatste laag van 4 in zelfklevend verband. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Bacteriële inoculatie. (A) Opstelling voor de inoculatie met Pseudomonas aeruginosa (PA01) op dag 3 na verbranding. (B) Topische toediening van het entmateriaal met een pipet met een volume van 500 μl voor elke wond. (C) Het inoculum wordt gelijkmatig over het wondoppervlak verdeeld met behulp van een steriele wegwerpspreider. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Voortgang van de wondgenezing en bevestiging van de biofilm. (A) Representatieve beelden van de wondsluiting gedurende de tijdlijn van het onderzoek. Schaalbalk = 1 cm. (B) Kwantificering van het wondgebied en TEWL-metingen over de tijdlijn van het onderzoek (n = 6). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. N.S. verwijst naar de TEWL-waarde van een normale huid. (C) Schematisch diagram met verschillende plaatsen van wondbiopsie. D. H&E-kleuring met de bijbehorende Masson’s trichrome kleuring die vervorming en necrose van alle huidlagen vertoont op dag 3 na verbranding en dag 7 na inoculatie. Schaalbalk = 500 μm. (E) Representatieve digitale beelden van niet-selectieve agar (Luria-Bertani-agar) en selectieve agar (Pseudomonas Isolation Agar) met bacteriekolonies gekweekt uit varkenswondbedweefsel. Het selectieve medium maakt het mogelijk om alleen de PA01-kolonies nauwkeurig te tellen. (F) Er wordt een berekening van de monsterkolonievormende eenheid (CFU) getoond op basis van de kolonietellingen die zijn genomen van verwerkte wondbiopten op dag 7 na inoculatie. (G) Representatieve scanning-elektronenmicroscopie (SEM)-beelden van de geïnoculeerde brandwonden op dag 7 na inoculatie met de gevestigde PA01-biofilm, met een ingezoomd beeld aan de rechterkant. Schaalbalk = 1 μm. De rode pijlpunten wijzen naar extracellulaire polymere stoffen (EPS). (H) P. aeruginosa op de brandwonden werden gevisualiseerd met behulp van anti-Pseudomonas (groen) antilichaam; de immunofluorescentiebeelden van de dag 7 wondbiopten na inoculatie tonen zware kolonisatie van de wondweefsels door P. aeruginosa. Schaalbalk = 100 μm. (I) Representatief mozaïek (schaalbalk = 200 μm) en bijbehorende ingezoomde (schaalbalk = 50 μm) beelden van ZO-1- en ZO-2-gekleurde secties op dag 35 en dag 56 na inoculatie, die een verminderde expressie van de eiwitten na de geïnduceerde infectie aantonen. De in LGO ingebedde bevroren secties (10 μm) werden gekleurd met anti-ZO-1 (groen) of anti-ZO-2 (groen). De secties werden verzonken met DAPI. De staafdiagrammen geven de kwantificering van de ZO-1 en ZO-2 signaalintensiteit weer. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 3); * p < 0,05 in vergelijking met spontane. Mann-Whitney of Kruskal-Wallis eenrichtingsanalyse van variantietests werd uitgevoerd om de significantie te testen. Figuur 7H,I is aangepast ten opzichte van Roy et al.13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit rapport biedt een gedetailleerd protocol voor het opzetten van een varkensmodel van chronische wondbiofilminfectie voor experimentele studies. Er zijn eerder verschillende biofilmmodellen voor varkens gerapporteerd 22,23,24,25,26, maar geen van hen zijn varkensmodellen met langetermijnstudies van 8 weken. Chronische wonden zijn wonden die 4 weken of langer open blijven 14,27,28. Er zijn geen andere chronische wondbiofilmmodellen gerapporteerd in de literatuur. Dit werk richt zich op de notie van functionele wondsluiting 2,7,13,15,17,29. Een studie uitgevoerd in 2014 was de eerste die meldde dat biofilm-geïnfecteerde wonden kunnen sluiten zonder het herstel van de barrièrefunctie7. De meting van de huidbarrièrefunctie in de genezende wond met behulp van transepidermaal waterverlies (TEWL) wordt in dit werk gerapporteerd.

Anatomisch en fysiologisch komt de huid van varkens, in vergelijking met de huid van andere kleine dieren, beter overeen met de menselijke huid32,33,34. Zowel de varkens- als de mensenhuid heeft een dikke epidermis 33, en de dermale-epidermale dikteverhouding varieert van 10:1 tot13:1 bij varkens, wat vergelijkbaar is met die van mensen34,35. Histologisch en biomechanisch vertoont de huid van mensen en varkens overeenkomsten in de rete-ridges, onderhuids vet, dermaal collageen, haarverdeling, adnexale structuren en bloedvatgrootte en -verdeling36,37,38. Functioneel gezien delen zowel varkens als mensen overeenkomsten in de samenstelling van de lipide-, eiwit- en keratinecomponenten van de epidermale laag, evenals vergelijkbare immunohistologische patronen37,38. Het immuunsysteem van varkens vertoont, in vergelijking met dat van andere kleine dieren, grotere overeenkomsten met het menselijke immuunsysteem, wat betekent dat varkens een geschikt model zijn voor studies naar de gastheerinteracties die een integraal onderdeel zijn van de complexiteit van de pathologische biofilm bij wondinfecties39. De kritische beoordeling van de voor- en nadelen van verschillende diermodellen heeft geleid tot de consensus dat varkens een efficiënt model vormen voor het bestuderen van wondgenezing34,38. Bovendien ontwikkelen gedomesticeerde varkens spontaan chronische bacteriële infecties, zoals waargenomen bij mensen10. Het brandwondenapparaat dat wordt gebruikt om de wonden te maken, is een geavanceerd en geautomatiseerd brandwondenapparaat dat warmte-energie levert op basis van een temperatuur die wordt afgelezen van de beoogde huidplaats22,40. Een dergelijke aanpak verbetert de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de brandwond. Het gebruik van humane klinische isolaten van bacteriën om de varkenswonden te infecteren voegt waarde toe als preklinisch model.

Brandwonden zijn complex en veroorzaken verschillende systemische verstoringen20,41. Het is dus belangrijk om het varken te reanimeren met voldoende vocht en onderkoeling tijdens anesthesie en herstel te voorkomen. Verschillende factoren kunnen de wondgenezing verstoren, waaronder de voeding, vloeistoffen en pijn na de brandwond42. Nauwgezette opvolging van de voedings- en pijnbeoordelingen is daarom van belang. Pijn na verbranding kan ernstig zijn en het gedrag en dieet van het dier beïnvloeden. Interventies om gedragsproblemen aan te pakken, moeten actief worden overwogen. Regelmatige en continue pijnscores en -behandeling zijn absoluut noodzakelijk. In dit protocol is een grondig pijnbeoordelingsblad opgenomen met een zeer gedetailleerd pijnbestrijdingsplan. Om kruisbesmetting tussen de wonden te voorkomen, moet speciale aandacht worden besteed aan het aanbrengen van de eerste laag van het verband op elke wond afzonderlijk. Kritische zorg moet worden besteed aan het omgaan met alle biologisch gevaarlijke materialen en bij het uitvoeren van de grondige desinfectie van de apparatuur, gereedschappen en de hele operatiekamer. Het aanbrengen van meerdere lagen van het verband voorkomt dat het varken de wonden blootlegt tijdens hun poging om de jeuk terug te wrijven of te krabben.

Het varken in het huidige model werd niet aangetast door onderliggende stofwisselingsstoornissen (bijv. diabetes), en daarom was het bestudeerde effect puur de impact van de bacteriële biofilminfectie op wondgenezing. Het model leent zich echter voor de inductie van diabetes (bijvoorbeeld met behulp van streptozotocine) en zou kunnen worden gebruikt om biofilminfectie te bestuderen in relatie tot een onderliggende stofwisselingsziekte. De andere beperking van het model is de gecontroleerde infectiesetting met behulp van P. aeruginosa, een bacterie. Verwacht wordt dat de normale huidmicroflora van het varken ook in de wond kan groeien en de genezing kan beïnvloeden. Verdere analyse met behulp van NGS of andere geavanceerde technieken om de microbiële inhoud van de wond af te bakenen is noodzakelijk. Het huidige model kan ook worden toegepast op gemengde infecties met verschillende microbiële soorten (bijv. schimmel, viraal, enz.). Dit is een belangrijk element, omdat klinisch relevante wonden waarschijnlijk worden bevolkt door gemengde microben, die de wondgenezing verschillend kunnen beïnvloeden.

Er zijn veel potentiële voordelen in dit model, waaronder de gelijkenis met de complexiteit en langetermijngevolgen van menselijke chronische wonden, het geautomatiseerde en reproduceerbare brandwondenproces en het gebruik van klinisch geïsoleerde bacteriesoorten. Het gebruik van meerdere niet-invasieve beeldvormingsmodaliteiten vertegenwoordigt een krachtige benadering voor het verzamelen van nuttige fysiologische gegevens die de wond kenmerken. Ten slotte is de beoordeling van de functionele wondgenezing via het herstel van de huidbarrièrefunctie op basis van TEWL van cruciaal belang. Concluderend wordt in dit werk een robuust, eenvoudig, gedetailleerd en gebruiksvriendelijk protocol getoond om een met biofilm geïnfecteerde ernstige brandwonden te ontwikkelen met behulp van een varkensmodelsysteem.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen het Laboratory Animal Resource Center (LARC), Indiana University, bedanken voor hun steun en de veterinaire zorg voor de dieren tijdens het onderzoek. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health-subsidies NR015676, NR013898 en DK125835 en de subsidie van het ministerie van Defensie W81XWH-11-2-0142. Bovendien profiteerde dit werk van de volgende National Institutes of Health-onderscheidingen: GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 en NS42617.

Materials

Sedation
Ketamine Zoetis 10004027 100mg/ml
Telazol Zoetis 106-111 100mg/ml
Xylazine Pivetal 04606-6750-02 100mg/ml Anased
3ml syringe w/ 20g needle Covidien-Monoject 8881513033
Winged infusion set 21g Jorgensen Labs J0454B
Anesthetic
Isoflurane Pivetal 21295097
Surgery
Hair clippers Wahl 8787-450A
Nair Church and Dwight Co. Inc 70506572
Chlorhexidine Solution First Priority Inc. 179925722
70% Isopropyl Alcohol Uline S-17474
0.9% Saline Solution ICU Medical  RL-7282
Non-woven gauze Pivetal 21295051
Paper tape McKesson 455531
2" Elastic tape Pivetal 21300869
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Spay hook Jorgensen Labs J0112A
Sterile lube McKesson 16-8942
Laryngoscope Jorgensen Labs J0449S
Roll gauze Pivetal 21295032
Endotracheal tube (7-9mm) Covidien 86112 Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed
15gtt/ml IV administration set ICU Medical 12672-28
LRS 1000ml bag ICU Medical 07953-09
Three Quarter Drape Sheet McKesson 16-i80-12110G
Analgesia
Buprenorphine RX Generics 42023-0179-05 0.3mg/ml
Fentanyl Transdermal
Carprofen 21294548 Pivetal 50mg/ml Levafen
Bandaging
Transparent film dressing 26×30 Genadyne Biotechnologies A4-S00F5
Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style McKesson 886408
Vetrap 3M 1410BK BULK
Elastic tape 4" Pivetal 21300931
Kerlix Roll Gauze Cardinal Health 3324
Imaging
Canon EOS 80D Canon 1263C004
Speedlight 600EX II-RT Canon 1177C002
EFS 17-55mm Ultrasonic Canon 1242B002
GE Logiq E9 GE 5197104-2
ML6-15 Probe GE 5199103
PeriCamPSI Perimed 90-00070
DermaLab Cortex Technologies Inc 4608D78
Biopsy/Tissue Collection
6mm punch biopsy Integra Lifesciences 33-36
bupivicaine 0.5% Auromedics Pharma 55150017030
Size 10 Disposable Scalpel McKesson 16-63810
Dissection scissors Pivetal 21294806
Rat tooth thumb tissue forceps Aesculap BD512R
Non-adherent Dressing Covidien 2132 Telfa
50ml Conical tube Falcon 352070
Eppendorf/microcentrifuge tube Fisherbrand 02-681-320
OCT Cassette
Non Woven Gauze 4×4 Pivetal 21295051
Inoculum
Low salt LB agar Invitrogen 22700-025
Low salt LB broth Fisher scientific BP1427-500
Petri plate Falcon REF-351029
Polyprophyline round bottom tubes (14 ml) Falcon REF-352059
Pseudomonas Agar Base (Dehydrated) Thermo Scientific OXCM0559B
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) 22700025
Gibco™ DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133
Euthanasia
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 9373
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Goodwine, J., et al. Pyruvate-depleting conditions induce biofilm dispersion and enhance the efficacy of antibiotics in killing biofilms in vitro and in vivo. Scientific Reports. 9 (1), 3763 (2019).
  2. Sen, C. K., Roy, S., Mathew-Steiner, S. S., Gordillo, G. M. Biofilm management in wound care. Plastic and Reconstructive Surgery. 148 (2), 275-288 (2021).
  3. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clinical Microbiology Reviews. 19 (2), 403-434 (2006).
  4. Nguyen, T. T., Gilpin, D. A., Meyer, N. A., Herndon, D. N. Current treatment of severely burned patients. Annals of Surgery. 223 (1), 14-25 (1996).
  5. Eriksson, E., et al. Chronic wounds: Treatment consensus. Wound Repair and Regeneration. 30 (2), 156-171 (2022).
  6. Lebeaux, D., Chauhan, A., Rendueles, O., Beloin, C. From in vitro to in vivo models of bacterial biofilm-related infections. Pathogens. 2 (2), 288-356 (2013).
  7. Ganesh, K., et al. Chronic wound biofilm model. Advances in Wound Care. 4 (7), 382-388 (2015).
  8. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
  9. Stewart, P. S. Biophysics of biofilm infection. Pathogens and Disease. 70 (3), 212-218 (2014).
  10. Jensen, L. K., Johansen, A. S. B., Jensen, H. E. Porcine models of biofilm infections with focus on pathomorphology. Frontiers in Microbiology. 8, 1961 (2017).
  11. Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in Microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
  12. Gonzalez, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response. Pathogens and Disease. 76 (3), 023 (2018).
  13. Roy, S., et al. Mixed-species biofilm compromises wound healing by disrupting epidermal barrier function. Journal of Pathology. 233 (4), 331-343 (2014).
  14. Sen, C. K. Human wound and its burden: Updated 2020. Compendium of Estimates. Advances in Wound Care. 10 (5), 281-292 (2021).
  15. Barki, K. G., et al. Electric field based dressing disrupts mixed-species bacterial biofilm infection and restores functional wound healing. Annals of Surgery. 269 (4), 756-766 (2019).
  16. Dusane, D. H., et al. Electroceutical treatment of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Scientific Reports. 9 (1), 2008 (2019).
  17. Roy, S., et al. Staphylococcus aureus biofilm infection compromises wound healing by causing deficiencies in granulation tissue collagen. Annals of Surgery. 271 (6), 1174-1185 (2020).
  18. Ghanbari, A., et al. Inoculation density and nutrient level determine the formation of mushroom-shaped structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Scientific Reports. 6, 32097 (2016).
  19. Yin, R., Cheng, J., Wang, J., Li, P., Lin, J. Treatment of Pseudomonas aeruginosa infectious biofilms: Challenges and strategies. Frontiers in Microbiology. 13, 955286 (2022).
  20. Norbury, W., Herndon, D. N., Tanksley, J., Jeschke, M. G., Finnerty, C. Infection in burns. Surgical Infections. 17 (2), 250-255 (2016).
  21. Nitz, F., et al. Molecular detection of drug-resistance genes of bla(OXA-23)-bla(OXA-51) and mcr-1 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Microorganisms. 9 (4), 786 (2021).
  22. Davis, S. C., et al. Microscopic and physiologic evidence for biofilm-associated wound colonization in vivo. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 23-29 (2008).
  23. Breuing, K., Kaplan, S., Liu, P., Onderdonk, A. B., Eriksson, E. Wound fluid bacterial levels exceed tissue bacterial counts in controlled porcine partial-thickness burn infections. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (2), 781-788 (2003).
  24. Nusbaum, A. G., et al. Effective method to remove wound bacteria: Comparison of various debridement modalities in an in vivo porcine model. Journal of Surgical Research. 176 (2), 701-707 (2012).
  25. Hirsch, T., et al. Enhanced susceptibility to infections in a diabetic wound healing model. BMC Surgery. 8, 5 (2008).
  26. Roche, E. D., et al. Increasing the presence of biofilm and healing delay in a porcine model of MRSA-infected wounds. Wound Repair and Regeneration. 20 (4), 537-543 (2012).
  27. Hartoch, R. S., McManus, J. G., Knapp, S., Buettner, M. F. Emergency management of chronic wounds. Emergency Medical Clinics of North America. 25 (1), 203-221 (2007).
  28. Mustoe, T. Understanding chronic wounds: a unifying hypothesis on their pathogenesis and implications for therapy. American Journal of Surgery. 187 (5), 65-70 (2004).
  29. Bhattacharya, M., et al. Staphylococcus aureus biofilms release leukocidins to elicit extracellular trap formation and evade neutrophil-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7416-7421 (2018).
  30. Chum, H., Pacharinsak, C. Endotracheal intubation in swine. Lab Animal. 41 (11), 309-311 (2012).
  31. Sinha, M., et al. Pseudomonas aeruginosa theft biofilm require host lipids of cutaneous wound. Annals of Surgery. 277 (3), e634-e647 (2023).
  32. Fan, G. Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
  33. Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration. 9 (2), 66-76 (2001).
  34. Meyer, W., Schwarz, R., Neurand, K. The skin of domestic mammals as a model for the human skin, with special reference to the domestic pig. Current Problems in Dermatology. 7, 39-52 (1978).
  35. Vardaxis, N. J., Brans, T. A., Boon, M. E., Kreis, R. W., Marres, L. M. Confocal laser scanning microscopy of porcine skin: implications for human wound healing studies. Journal of Anatomy. 190, 601-611 (1997).
  36. Heinrich, W., Lange, P. M., Stirtz, T., Iancu, C., Heidemann, E. Isolation and characterization of the large cyanogen bromide peptides from the alpha1- and alpha2-chains of pig skin collagen. FEBS Letters. 16 (1), 63-67 (1971).
  37. Marcarian, H. Q., Calhoun, M. L. Microscopic anatomy of the integument of adult swine. American Journal of Veterinary Research. 27 (118), 765-772 (1966).
  38. Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration. 9 (2), 66-76 (2001).
  39. Dawson, H. D., et al. Structural and functional annotation of the porcine immunome. BMC Genomics. 14, 332 (2013).
  40. Kim, J. Y., Dunham, D. M., Supp, D. M., Sen, C. K., Powell, H. M. Novel burn device for rapid, reproducible burn wound generation. Burns. 42 (2), 384-391 (2016).
  41. Nielson, C. B., Duethman, N. C., Howard, J. M., Moncure, M., Wood, J. G. Burns: Pathophysiology of systemic complications and current management. Journal of Burn Care and Research. 38 (1), e469-e481 (2017).
  42. Rowan, M. P., et al. Burn wound healing and treatment: Review and advancements. Critical Care. 19 (1), 243 (2015).

Tags

Swine ModelBiofilm InfectionWound ChronicityPreclinical ModelClinically Isolated PathogensWound Biofilm FormationHost-microbe InteractionsBiofilm AggregatesWound Barrier FunctionTransepidermal Water LossIn Vivo StudiesHost Immune ResponseBiofilm Maturation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
El Masry, M., Bhasme, P., Mathew-Steiner, S. S., Smith, J., Smeenge, T., Roy, S., Sen, C. K. Swine Model of Biofilm Infection and Invisible Wounds. J. Vis. Exp. (196), e65301, doi:10.3791/65301 (2023).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image