Un modèle murin pour la néovascularisation cornéenne par brûlure alcaline

Tous les travaux sur les animaux, y compris les procédures expérimentales et l’euthanasie, ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) du Baylor College of Medicine sous le numéro de protocole AN-8790. 1. Préparation de 1 N NaOH Ajouter 4 mL d’eau stérile déminéralisée dans un tube à centrifuger de 15 mL. Pesez 400 mg d’hydroxyde de sodium (NaOH) et ajoutez-les soigneusement dans le tube. Dissoudre le NaOH en remuant lentement la solution à l’aide d’une tige de verre. Augmentez le volume à 10 ml en ajoutant de l’eau déminéralisée stérile dans le tube, puis mélangez à nouveau en retournant doucement le tube de haut en bas. Fermez hermétiquement le bouchon et conservez la solution à température ambiante. Préparez la solution fraîche tous les mois car la concentration de la solution de NaOH peut être réduite par la solution absorbant le dioxyde de carbone dans l’air. Mélangez toujours délicatement la solution de NaOH avant utilisation.ATTENTION : Préparez la solution à l’intérieur d’une hotte chimique et portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié. 2. Préparation de la solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % Ajouter 30 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x dans un bécher en verre. Pesez 4 g de paraformaldéhyde (PFA) et ajoutez-le au bécher. Maintenez le bécher sur une plaque chauffante à 60 °C en remuant. Ajouter la solution de NaOH 1 N goutte à goutte pour augmenter le pH jusqu’à ce que la solution s’éclaircisse. Vérifiez et ajustez le pH à 7,4 à l’aide de 1 N d’acide chlorhydrique (HCl). Ajustez le volume final à 50 mL avec 1x PBS. Refroidir et filtrer la solution. Conserver la solution à 4 °C.ATTENTION : Préparez la solution dans une hotte tout en portant un EPI approprié. 3. Préparation du cocktail kétamine/xylazine Préparer le cocktail kétamine/xylazine en ajoutant 0,8 mL de kétamine (concentration de base : 100 mg/mL) et 0,16 mL de xylazine (concentration de base : 100 mg/mL) à 9,4 mL de solution saline. Conservez le cocktail dans des flacons d’injection stériles à température ambiante (RT). 4. Brûlure alcaline sur la cornée de la souris Injecter du méloxicam (4 à 6 mg/kg de poids corporel) par voie sous-cutanée 30 minutes avant l’intervention pour soulager la douleur. Anesthésier les souris (C57BL/6J, 6-8 semaines, mâles) à l’aide d’une injection i.p. du cocktail kétamine/xylazine (kétamine 80 mg/kg et xylazine 16 mg/kg de poids corporel). Vérifiez la réponse réflexe (retrait de la pédale) en pinçant les orteils de la souris, et confirmez l’absence du réflexe. Appliquez une goutte d’anesthésique topique, 0,5 % de proparacaïne, sur la surface cornéenne d’un œil et une goutte de larmes artificielles sur l’autre œil. À l’aide d’un poinçon de biopsie de 2 mm, découpez des disques de papier filtre Whatman. Ajouter 2 μL de NaOH 1N dans une boîte de Pétri propre. Placez le disque de papier filtre de 2 mm sur la goutte de NaOH 1 N et laissez-la tremper pendant 15 s. Prenez le papier filtre à l’aide d’une pince et appliquez-le sur l’œil traité à la proparacaïne au centre de la cornée pendant 30 s.REMARQUE : Le papier filtre ne doit toucher que le centre de la cornée et des précautions doivent être prises pour éviter le mouvement du papier filtre une fois placé, car déplacer le papier filtre peut provoquer des brûlures aux tissus adjacents. Laver l’œil en rinçant avec 20 mL de solution saline stérile dans une seringue stérile.REMARQUE : Des précautions doivent être prises pour s’assurer que la cornée, ainsi que le sac conjonctival, sont soigneusement lavés pour éviter d’endommager davantage la cornée ou les tissus environnants. Le lavage du sac conjonctival empêchera davantage le symblépharon. Essuyez délicatement l’excès de sérum physiologique des yeux et de la zone environnante à l’aide de lingettes douces jetables. Ensuite, gardez les souris dans une cage de récupération sur un coussin chauffant chaud jusqu’à ce qu’elles soient ambulatoires.REMARQUE : Les souris sont surveillées quotidiennement après la brûlure alcaline pendant 3 jours. Si des symptômes de douleur ou de stress sont observés, le méloxicam (4-6 mg/kg de poids corporel) est administré par voie sous-cutanée. 5. Examen et évaluation de la néovascularisation et de l’opacité Chez les souris anesthésiées, examiner les yeux au microscope à dissection le 10e jour après la brûlure et obtenir des images à l’aide d’une caméra fixée à la lunette de dissection pour évaluer l’opacité et la néovascularisation.REMARQUE : Un endoscope de dissection ordinaire avec une caméra attachée est suffisant. Lors de l’observation de la cornée au microscope de dissection, notez l’opacité après la brûlure en fonction de l’échelle12 suivante :0 = Pas d’opacité ; cornée claire1 = Légère opacité ; léger flou dans les régions de l’iris et de la pupille ; L’iris et la pupille sont bien visibles2 = Opacité modérée ; L’iris et la pupille sont à peine visibles3 = Opacité sévère ; L’iris ou la pupille ne sont pas visibles4 = Cornée opaque ; L’iris et la pupille ne sont pas visibles Lors de l’observation de la cornée à l’aide du microscope de dissection, notez le CoNV sur la base de l’échelle suivante12 :0 = Pas de néovascularisation ; Pas de nouveaux vaisseaux du limbe1 = Néovascularisation légère ; Nouveaux vaisseaux provenant du limbe2 = Néovascularisation modérée ; Les vaisseaux sanguins provenaient du limbe et se développaient vers le centre de la cornée3 = Néovascularisation sévère ; vaisseaux sanguins provenant du limbe et atteignant et/ou traversant le centre de la cornée Utilisez un test t de Student pour comparer statistiquement les scores d’opacité et de néovascularisation entre les groupes de brûlures alcalines et d’yeux sains. Euthanasier les souris au jour 10 par exposition à l’isoflurane à 5 % jusqu’à 1 minute après l’arrêt de la respiration, suivie d’une luxation cervicale, et prélever les cornées pour une imagerie à montage plat. 6. Imagerie par tomographie par cohérence optique (OCT) Prenez des images OCT du segment antérieur des yeux chez des souris anesthésiées le 10e jour après la brûlure. Effectuez l’acquisition d’images OCT sous forme de balayage de volume en mode IR + OCT avec un champ de vision de 30° et une intensité IR de 100 %. Quantifier l’épaisseur des cornées à l’aide du logiciel ImageJ. Pour mesurer l’épaisseur, utilisez l’outil Sélection de ligne du logiciel ImageJ pour créer une ligne droite entre les surfaces antérieure et postérieure au niveau de la cornée centrale. Cliquez sur Analyser > Mesurer dans les outils logiciels pour transférer les valeurs dans la fenêtre de données. Copiez les valeurs dans un fichier de feuille de calcul et comparez statistiquement l’épaisseur de la cornée entre les groupes oculaires de brûlure alcaline et d’œil sain à l’aide d’un test t de Student.REMARQUE : L’épaisseur de la cornée est la distance entre un point de la surface cornéenne antérieure et le point le plus proche de la surface cornéenne postérieure au centre de la cornée. 7. Immunomarquage pour CoNV sur les cornées à montage plat Euthanasiez les souris au 10e jour après une brûlure alcaline et énucléez les yeux par dissection contondante. Écartez les paupières à l’aide du pouce et de l’index, et placez une pince sous le globe oculaire. Fermez la pince et retirez doucement le globe oculaire de l’orbite. Placez les globes oculaires dans 1x PBS. Pour chaque globe oculaire, retirez la cornée du globe oculaire en pratiquant d’abord une incision à l’aide d’une aiguille de 30 G sous la zone du limbe. Coupez autour de la zone du limbe à l’aide de micro-ciseaux cornéens, avec l’incision comme point de départ, et séparez lentement la cornée et le limbe du globe. Nettoyez délicatement les cornées à l’aide d’un pinceau fin pour enlever l’iris. Fixez les cornées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 1 h. Lavez les cornées trois fois pendant 20 minutes chacune dans 1x PBS à température ambiante (RT). Incuber dans un tampon bloquant (1 PBS complété par 0,1 % de Triton-X 100 et 5 % d’albumine sérique bovine [BSA]) pendant 1 h à RT. Transférez les cornées dans une solution d’anticorps contenant des anticorps primaires. Préparez la solution d’anticorps dans 1x PBS complété par 1 % de BSA, 0,1 % de Triton-X 100, un anticorps monoclonal anti-CD31 conjugué Dylight550 (1 :100) et un anticorps monoclonal anti-LYVE-1 conjugué Alexa Fluor488 (1 :100). Incuber pendant 3 jours à 4 °C. Lavez les cornées dans 1x PBS trois fois pendant 20 min chacune. Colorer les noyaux à l’aide de la solution colorante Hoechst (1 :1 000) pendant 5 min dans l’obscurité. Aplatissez les cornées avec des coupes radiales et montez-les sur une lame de verre pré-nettoyée à l’aide d’un support de montage et de lamelles. Scellez les lamelles avec du vernis à ongles transparent et séchez les lames pendant la nuit dans l’obscurité avant de les analyser par microscopie confocale. Imager les cornées à montage plat à l’aide de la microscopie confocale en assemblant des images individuelles de la pile en Z ; Utilisez un objectif 10x, des lasers de 488 nm et 561 nm et une résolution de 512 pixels x 512 pixels par tranche sur les scanners Galvano non résonants. Quantifier la densité du sang CD31+ et des vaisseaux lymphatiques LYVE-1+ à l’aide du logiciel ImageJ. Pour déterminer la densité vasculaire, convertissez les images confocales en une image 8 bits. Choisissez Vascular Density dans les plugins. Choisissez la région qui vous intéresse sur l’image, puis cliquez sur OK. Les mesures s’ouvriront dans une nouvelle fenêtre de données. Copiez les valeurs dans un fichier de feuille de calcul et comparez statistiquement la densité vasculaire entre les groupes d’yeux de brûlure alcaline et d’yeux sains à l’aide d’un test t de Student.REMARQUE : CD31, également appelé molécule d’adhésion des cellules endothéliales plaquettaires-1 (PECAM-1), est une molécule d’adhésion cellulaire impliquée dans l’angiogenèse et est fortement exprimée dans les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins précoces et matures13. LYVE-1 (récepteur hyaluronique endothélial des vaisseaux lymphatiques-1) est un marqueur de surface cellulaire sur les cellules endothéliales lymphatiques et peut être utilisé comme marqueur de lymphangiogenèse14.