Immunofluorescentiebeeldvorming van neutrofiele extracellulaire vallen in menselijke en muizenweefsels

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s) werden voor het eerst gevisualiseerd door Brinkmann et al. als een route van cellulaire dood die verschilt van apoptose en necrose in 2004¹. In deze route geven neutrofielen hun gedecondenseerde chromatine af in de extracellulaire ruimte om grote webachtige structuren te vormen die bedekt zijn met antimicrobiële eiwitten die voorheen in de korrels of cytosolen waren opgeslagen. Deze antimicrobiële eiwitten omvatten neutrofiele elastase (NE), myeloperoxidase (MPO) en gecitrullineerd histon H3 (H3cit), die vaak worden gebruikt voor indirecte immunofluorescentiedetectie van NET’s². Deze methode identificeert niet alleen de kwantitatieve aanwezigheid van deze eiwitten; het heeft inderdaad het voordeel dat het specifiek NET-achtige structuren detecteert. In de NET’s co-lokaliseren de genoemde eiwitten samen met extracellulair DNA, wat kan worden gedetecteerd door een overlapping van de fluorescentiesignalen van elk gekleurd eiwit en het extracellulaire DNA. In tegenstelling tot de overlappende signalen als gevolg van extracellulaire co-lokalisatie van DNA en eiwitten in NET’s, vertonen intacte neutrofielen geen co-lokalisatie. Hier worden de NET-componenten meestal apart opgeslagen in de korrels, kernen en cytosol³.

Sinds hun eerste ontdekking is aangetoond dat NET een centrale rol spelen bij tal van ziekten, met name die waarbij ontstekingen betrokken zijn. NET’s vertonen antimicrobiële functies tijdens infectie door extracellulaire pathogenen in bloed en weefsel op te vangen en te doden ^4,5. NET is echter ook in verband gebracht met auto-immuunziekten en hyperinflammatoire reacties, zoals systemische lupus erythematosus, reumatische artritis en allergisch astma ^6,7,8. NET bevorderen vaso-occlusie en ontsteking bij atherosclerose, bloedplaatjeshechting en er wordt gespeculeerd dat ze een rol spelen bij uitgezaaide kanker 9,10,11. Desalniettemin wordt aangenomen dat ze ontstekingsremmende eigenschappen hebben door de pro-inflammatoire cytokineniveaus te verlagen¹². Terwijl NET steeds meer belangstelling krijgt in een breder onderzoeksgebied, is een robuuste NET-detectiemethode van fundamenteel belang voor toekomstig onderzoek.

Hoewel de visualisatie van NET’s in verschillende weefsels met behulp van immunofluorescentiebeeldvorming complex is en maatwerk vereist, afgezien van elektronenmicroscopie, is het momenteel een van de meest gerenommeerde methoden voor het visualiseren van de interacties tussen NET’s en cellen en wordt het voornamelijk gebruikt in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefsels (FFPE)^13,14. Het vergelijken van NET-beeldvorming is echter moeilijk, omdat verschillende laboratoria hun eigen aangepaste protocollen gebruiken. Deze protocollen verschillen in het gebruik van antilichamen, antigeenextractie of permeabilisatiemethode en zijn vaak geoptimaliseerd voor een specifiek type weefsel 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ^,27.

Nadat Brinkmann et al. de eerste methodische studie publiceerden met behulp van immunofluorescerende visualisatie van NET’s in FFPE-weefsel, wilden we dit protocol optimaliseren voor een grotere verscheidenheid aan weefsels en soorten¹⁵. Om een breed toepasbaar immunofluorescentieprotocol vast te stellen, hebben we bovendien verschillende aangepaste protocollen getest uit onderzoeken die immunofluorescentiemethoden in FFPE-weefsel gebruikten om NET’s te detecteren 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Verder hebben we een nieuw H3cit-antilichaam geprobeerd voor meer specifieke extracellulaire kleuring²⁸. Onze hypothese is dat door het systematisch aanpassen van de huidige kleuringsprotocollen aan verschillende soorten en weefsels, in vitro beeldvorming kan worden verbeterd, wat resulteert de een betere weergave van de interactie tussen neutrofielen en NET’s, zowel lokaal als systemisch.