Совмещение фиброграмм оптической когерентной томографии видимого света с конфокальными изображениями той же сетчатки мыши
Summary
В настоящем протоколе описаны шаги по совмещению in vivo изображений оптической когерентной томографии в видимом свете (vis-OCTF) с конфокальными изображениями той же сетчатки мыши ex vivo с целью верификации наблюдаемой морфологии пучка аксонов ганглиозных клеток сетчатки на изображениях in vivo.
Abstract
В последние годы визуализация сетчатки in vivo , которая предоставляет неинвазивную информацию о биологических системах и процессах в режиме реального времени и в течение длительного времени, все чаще применяется для получения объективной оценки повреждения нейронов при заболеваниях глаз. Конфокальная визуализация одной и той же сетчатки ex vivo часто необходима для подтверждения результатов in vivo , особенно в исследованиях на животных. В данной работе мы продемонстрировали метод выравнивания конфокального изображения сетчатки мыши ex vivo с ее изображениями in vivo . Новая клинически готовая технология визуализации, называемая оптической когерентной томографией видимого света (vis-OCTF), была применена для получения изображений сетчатки мыши in vivo . Затем мы выполнили конфокальную визуализацию той же сетчатки, что является «золотым стандартом», чтобы проверить изображения in vivo по сравнению с OCTF. Это исследование не только позволяет глубже изучить молекулярные и клеточные механизмы, но и закладывает основу для чувствительной и объективной оценки нейронных повреждений in vivo.
Introduction
Ганглиозные клетки сетчатки (RGC) играют важнейшую роль в обработке визуальной информации, получая синаптические входы через свои дендритные деревья во внутреннем плексиформном слое (IPL) и передавая информацию через свои аксоны в слое нервных волокон сетчатки (RNFL) в мозг 1,2,3,4. При таких заболеваниях, как глаукома, ранняя дегенерация RGC может привести к незначительным изменениям в RNFL, слое ганглиозных клеток (GCL), IPL и зрительном нерве как у пациентов, так и у грызуновмоделей 5,6,7,8,9. Таким образом, раннее выявление этих морфологических изменений в РГК имеет важное значение для своевременного вмешательства для предотвращения РГК и потери зрения.
Недавно мы разработали новую клинически готовую технологию визуализации, называемую оптической когерентной томографией видимого света (vis-OCT), чтобы удовлетворить потребность в мониторинге повреждений RGC in vivo. Vis-OCT улучшил осевое разрешение, достигнув 1,3 мкм в сетчатке10,11, что позволило визуализировать отдельные пучки аксонов RGC в RNFL. Впоследствии была создана виз-ОКТ-фибрография (vis-OCTF) для отслеживания и количественной оценки повреждений RGC на уровне пучка одиночных аксонов у мышей11,12,13. Тем не менее, конфокальная визуализация ex vivo той же сетчатки, что является золотым стандартом, часто необходима для подтверждения результатов in vivo. Таким образом, это исследование продемонстрирует, как выровнять изображения in vivo, полученные vis-OCTF, с конфокальными изображениями той же сетчатки мыши ex vivo. Протокол направлен на валидацию результатов de vivo с помощью конфокальной визуализации ex vivo и создание основы для изучения молекулярных и клеточных изменений, лежащих в основе повреждения RGC при болезненных состояниях.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе есть два этапа, которые требуют внимания. Во-первых, перед ОКТ-визуализацией необходимо убедиться, что животное находится под глубоким наркозом и что его глаза полностью расширены. Если мыши не находятся под адекватным наркозом, их учащенное дыхание может привести к не?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование поддержано Фондом исследования глаукомы, Грантом Шаффера, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 и Knights Templar Eye Foundation.
Materials
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antibodies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
| Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
Referências
- Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
- Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
- Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
- Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
- Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).
- Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
- Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
- Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
- Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
- Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).
- Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
- Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
- Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
- Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
- Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
- Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
- Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
- Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
- Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).
