I detta protokoll beskrivs stegen för att anpassa in vivo-bilder med optisk koherenstomografifibergrafi (vis-OCTF) i synligt ljus med ex vivo konfokala bilder av samma musnäthinna i syfte att verifiera den observerade morfologin för näthinnans gangliecellsaxonbunt i in vivo-bilderna.
Under de senaste åren har in vivo retinal avbildning, som ger icke-invasiv, realtids- och longitudinell information om biologiska system och processer, i allt högre grad tillämpats för att få en objektiv bedömning av nervskador vid ögonsjukdomar. Ex vivo konfokal avbildning av samma näthinna är ofta nödvändig för att validera in vivo-fynden, särskilt i djurförsök. I denna studie demonstrerade vi en metod för att anpassa en ex vivo konfokalbild av musens näthinna med dess in vivo-bilder. En ny klinisk avbildningsteknik som kallas synligt ljus optisk koherenstomografi fibergrafi (vis-OCTF) användes för att ta in vivo-bilder av musens näthinna. Vi utförde sedan den konfokala avbildningen av samma näthinna som “guldstandarden” för att validera in vivo vis-OCTF-bilderna. Denna studie möjliggör inte bara ytterligare undersökning av de molekylära och cellulära mekanismerna utan etablerar också en grund för en känslig och objektiv utvärdering av nervskador in vivo.
Retinala ganglieceller (RGC) spelar en avgörande roll i visuell informationsbearbetning, tar emot synaptiska intryck genom sina dendritiska träd i det inre plexiforma skiktet (IPL) och överför informationen via sina axoner i retinala nervfiberskiktet (RNFL) till hjärnan 1,2,3,4. Vid sjukdomstillstånd som glaukom kan tidig RGC-degeneration resultera i subtila förändringar i RNFL, gangliecelskiktet (GCL), IPL och synnerven hos både patienter och gnagarmodeller 5,6,7,8,9. Tidig upptäckt av dessa morfologiska förändringar i RGC är därför avgörande för att kunna ingripa i tid för att förhindra RGC och synförlust.
Vi har nyligen utvecklat en ny klinisk avbildningsteknik som kallas optisk koherenstomografi i synligt ljus (vis-OCT) för att tillgodose behovet av in vivo-övervakning av RGC-skador. Vis-OCT förbättrade den axiella upplösningen och nådde 1,3 μm i näthinnan10,11, vilket möjliggjorde visualisering av enskilda RGC-axonknippen i RNFL. Därefter etablerades vis-OCT-fibergrafi (vis-OCTF) för att spåra och kvantifiera RGC-skador på nivån för ett axonknippe i möss11,12,13. Ex vivo konfokalavbildning av samma näthinna som guldstandarden är dock ofta nödvändig för att validera in vivo-fynden. Därför kommer denna studie att visa hur man kan anpassa de vivo-bilder tagna av vis-OCTF med ex vivo konfokala bilder av samma musnäthinna. Protokollet syftar till att validera de vivo-fynden genom ex vivo konfokal avbildning och etablera en grund för att undersöka de molekylära och cellulära förändringar som ligger till grund för RGC-skador vid sjukdomstillstånd.
Det finns två steg i det här protokollet som kräver uppmärksamhet. För det första är det nödvändigt att se till att djuret är under djup bedövning och att ögonen är helt vidgade före ULT-avbildning. Om mössen inte är tillräckligt bedövade kan deras snabba andning leda till instabila rörelser i ansiktsbilderna , vilket kan påverka fibergrammets kvalitet negativt. Dessutom kan otillräcklig utvidgning också ha en negativ inverkan på bildkvaliteten eftersom iris kan hindra ljuset och hindra de…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöds av Glaucoma Research Foundation Shaffer Grant, 4-CA Cavalier Collaborative Award, R01EY029121, R01EY035088 och Knights Templar Eye Foundation.
Equipment | |||
Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
Drugs and antibodies | |||
4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |