Мультиплексная иммунофлюоресценция в сочетании с анализом пространственных изображений для клинико-биологической оценки микроокружения опухоли

Все образцы, использованные в настоящем протоколе, были получены в результате исследования, одобренного местными комитетами по этике и санкционированного компетентным органом. Все участники исследования дали письменное информированное согласие. Исследование зарегистрировано в ClinicalTrials.gov (NCT03608046). 1. Мультиплексная иммунофлюоресценция Секционирование FFPEЗафиксируйте ткань в 4% параформальдегиде и вставьте фиксированную ткань в парафин. Отрежьте срезы размером 5 мкм и поместите их на клейкие предметные стекла микроскопа. Высушите предметные стекла в течение ночи при комнатной температуре (RT). Депарафинизация и ингибирование эндогенных пероксидазДепарафиньте ткани, погрузив предметные стекла в толуол (3 раза по 5 мин каждый) и метанол (3 раза по 5 мин каждый) под вытяжной шкаф. Ингибируют эндогенные пероксидазы путем погружения предметных стекол в 3% перекись водорода, разбавленную в метаноле, на 20 мин под вытяжным шкафом. Промойте предметные стекла в дистиллированной (d) H2O (1x в течение 3 мин). Мультиплексное иммунофлюоресцентное окрашиваниеПогрузите предметные стекла в банку для окрашивания объемом 300 мл, содержащую 10 мМ цитратный (рН 6) или ЭДТА (рН 9) буфер с добавлением 0,1% TritonX-100.ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый буфер (рН 6 или рН 9) зависит от окрашенного антигена (см. Таблицу 1). Поместите банку для окрашивания с закрытой крышкой в микроволновую печь на 3-5 минут при максимальной мощности (например, 900 Вт), пока буфер не закипит.ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время для кипячения зависит от микроволновой печи и объема буфера. Корректировки могут потребоваться, чтобы найти идеальное время. Для некоторых хрупких антигенов или хрупких и менее адгезивных образцов (например, органоидов и сфероидов) кипячение в микроволновой печи может быть слишком резким. В этом случае вместо нее можно использовать скороварку. Держите буфер при температуре, близкой к кипению, поставив закрытую банку для окрашивания в микроволновую печь на низкой мощности (например, 90 Вт) на 15 минут. Выполните последний шаг нагрева, поставив микроволновую печь на максимальную мощность на 90 с. Выньте банку из микроволновой печи и дайте буферу остыть в течение 15 минут при RT. Промойте предметные стекла 3 раза в течение 5 мин каждый при dH2O и 1x в течение 5 мин в трис-буферизованном физиологическом растворе, содержащем 0,1% Tween 20 (TBS-T). Удалите TBS-T, промокнув предметные стекла на бумажном полотенце Поместите предметные стекла (плоские) на поддон камеры окрашивания или коробку для предметных стекол микроскопа (см. Таблицу материалов). Обведите ткань гидрофобной ручкой. Блокируйте неспецифические сайты связывания, покрывая ткань 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA), растворенным в TBS-T в течение 30 мин. Снимите блокирующий буфер, промокнув слайды на бумажном полотенце.ПРИМЕЧАНИЕ: Не промывайте слайды после этапа блокировки. Инкубируют ткань в течение 60 мин с первичным антителом (см. Таблицу 1), разведенным в 1% BSA TBS-T, покрывая ткань примерно 300 мкл раствора. Промойте предметные стекла 3 раза по 3 минуты с помощью TBS-T. Инкубируют ткань в течение 40 мин с вторичным антителом поли-HRP (см. Таблицу 1), покрывая ткань примерно 300 мкл раствора. Промойте предметные стекла 3 раза в течение 3 минут с помощью TBS-T. Инкубируют ткань в течение 10 мин с флуорохром-тирамидным реагентом (см. Таблицу 1), разбавленным в 200 раз в боратном буфере (0,1 М борат, рН 7,8, 3 М NaCl), экстемпорально дополненном 0,003% H 2O2 путем покрытия ткани примерно 300 мкл раствора. Промойте предметные стекла 3 раза в течение 3 минут с помощью TBS-T. Повторяйте шаги 1.3.1-1.3.16 до тех пор, пока не будет выполнено все окрашивание TSA. Инкубируйте ткань в течение ночи при 4 ° C с последним первичным антителом (см. Таблицу 1), разведенным в 1% BSA TBS-T.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку инкубация проводится в течение ночи, важно накрыть лоток камеры окрашивания или коробку предметного стекла микроскопа и добавить dH2O на бумажное полотенце на дно коробки (под предметными стеклами), чтобы убедиться, что ткани не высохнут во время инкубации. Промойте салфетку 3 раза в течение 5 минут с помощью TBS-T. Инкубируйте ткань в течение 120 мин с вторичным антителом (непосредственно связанным с флуорохромом), разбавленным в 200 раз в 1% BSA TBS-T. Промойте салфетку 3 раза в течение 5 минут с помощью TBS-T. Окрашивают ядра путем инкубации ткани в течение 5 мин в бисбензимиде (20 мМ), разбавленном в 1,000 раз в 10% BSA TBS-T.ПРИМЕЧАНИЕ: Бисбензимид можно заменить DAPI, но последний более токсичен и с ним нужно осторожно обращаться под вытяжным шкафом. Промойте салфетку 3 раза в течение 3 минут каждый при dH2O. Установите предметные стекла с помощью флуоресцентной монтажной среды и боросиликатных покровных стекол. 2. Сканирование слайдов Оцифруйте слайды, отсканировав их на флуоресцентном сканере слайдов с 20-кратным увеличением (подробная информация о сканере слайдов приведена в таблице материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативное сканирование оптимального мультиплекса показано на рисунке 1. 3. Анализ изображений Импортируйте сканы в программное обеспечение для анализа изображений (File > Open Image). Перейдите на вкладку «Классификаторы» и выберите плагин DenseNet AI V2 . Обучите плагин DenseNet AI V2 распознавать ядра, окружая около 500 ядер на одном изображении. Обучите ИИ на нескольких других предметных стеклах из той же партии и разных партиях окрашивания mIF, окружив несколько ядер (50) на нескольких предметных стеклах (около 10).ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные инструкции по использованию плагина AI можно найти в руководстве по программному обеспечению. Использование ИИ для обнаружения ядер не является обязательным. Другие методы обнаружения ядер доступны в зависимости от используемого программного обеспечения для анализа изображений. Сохраните обученный ИИ (действия классификатора > сохранение). Перейдите на вкладку « Аннотации» и создайте аннотацию для каждой интересующей области (ROI), такой как центр опухоли и край опухоли, с помощью инструмента «Перьевая аннотация». При необходимости удалите области со складками и размытые области с помощью инструмента аннотации исключений.ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание гематоксилин-эозином участка, прилегающего к участку, используемому для mIF, может быть выполнено перед окрашиванием mIF, чтобы убедиться, что опухолевые клетки присутствуют в образце, и помочь анатомопатологам определить ROI. Перейдите на вкладку «Анализ» и выберите алгоритм HighPlex FL («Действия настроек» > «Загрузить» > HighPlex FL). Перейдите на вкладку «Выбор красителя » и выберите интересующий краситель. На вкладке « Ядерное обнаружение » перейдите в раздел «Тип ядерной сегментации» и выберите «Пользовательский ИИ». В классификаторе ядерной сегментации выберите ИИ, сохраненный на шаге 3.5. Во вкладке «Обнаружение мембраны и цитоплазмы» выберите максимальный радиус цитоплазмы (в данном исследовании использовался 1,5) и количество мембранных красителей. Для каждого красителя выберите положительный порог ядра, положительный порог цитоплазмы и положительный порог мембраны.ПРИМЕЧАНИЕ: Порог различен для каждого окрашивания и должен быть скорректирован для каждой партии предметных стекол и каждого окрашенного антигена. Использование инструмента « Настройки просмотра » («Настройки просмотра» > «Просмотр») может помочь выбрать адекватное пороговое значение, используя значение интенсивности в конце пика интенсивности (справа). Для каждого красителя выберите процент полноты ядра, мембраны и цитоплазмы.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот параметр важен, чтобы избежать ложноположительного обнаружения, когда две клетки с разным окрашиванием находятся близко друг к другу (рис. 2). Сохраните алгоритм (Действия настроек > Сохранить). Проанализируйте рентабельность инвестиций (Analyze > Annotation Layer). Перейдите на вкладку « Результаты » и выберите все данные в разделе «Данные объекта » (ctrl + A). Экспортируйте данные в .csv формате (щелкните правой кнопкой мыши > Export > Object Data. CSV).ПРИМЕЧАНИЕ: Эта таблица содержит положение (Xmin, Xmax; Ymin, Ymax) и положительность каждого маркера каждой анализируемой клетки. 4. Биоинформатика с использованием R ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипт R, предоставляющий более подробную информацию о следующих шагах, доступен на GitHub (benidovskaya/Ring: Pipeline for analysis of multiplex immunofluorescence stainings. [github.com]) Используя экспортированную таблицу, сначала определите различные типы клеток на основе окрашивания колокализации. Например, определяют цитотоксические Т-клетки по двойным положительным клеткам CD3+/CD8+. Затем восстановите упрощенное изображение слайда на точечном графике, используя координаты, экспортированные из программного обеспечения для анализа изображений, и ggplot2 (Рисунок 3). Используя эти данные, можно выполнить несколько видов анализа:Анализ плотностиПРИМЕЧАНИЕ: Простейшим анализом является анализ плотности.Проведите анализ плотности для всех типов клеток, используя весь предметный стекол для биопсии или какую-то конкретную область ткани. Например, вычислите плотность CD3+ и CD8+ Т-клеток в центре опухоли и на краю опухоли (рис. 4A-C). Чтобы вычислить эти плотности, используйте программное обеспечение для анализа изображений, чтобы создать определенный кадр данных для каждого образца с фенотипом и координатами каждой клетки. С помощью функции кластеризации (k-ближайший сосед) на R создайте полигональный объект, используя границы исследуемой биопсии, и вычислите плотность интересующих типов клеток внутри него.ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет сравнивать плотности различных типов клеток между различными условиями (такими как разные моменты времени, типы лечения, типы тканей и реакция на лечение) и локализациями (центр опухоли, край опухоли, фиброз стромы и область некроза) в зависимости от биологической гипотезы. Из-за высокой близости между раковыми клетками, периопухолевыми клетками и клетками, проникающими в опухоль, программное обеспечение для анализа изображений может обнаруживать двойные положительные клетки как иммунные и раковые клетки одновременно. В этом случае нужно биоинформационно исправить эту проблему, упомянув, что это за двойные положительные клетки. В этом случае клетки CD3 + CD8 + цитокератин+ были помечены как цитотоксические клетки, потому что цитокератин-положительный результат был обусловлен опухолевыми клетками, окружающими инфильтрирующие лимфоциты. Тепловые картыИспользуя плотность каждого типа ячеек с разных панелей и применяя нормализацию (например, масштабирование, центрирование), нарисуйте тепловые карты (рис. 5), представляющие обилие ячеек в популяции образцов. Используя иерархическую неконтролируемую кластеризацию, основанную на плотности клеток, кластеризуйте пациентов с аналогичными составами TME и соотнесите эти кластеры с клиническими параметрами, такими как ответ на лечение и выживаемость.ПРИМЕЧАНИЕ: Тепловые карты и кластеризация могут быть легко выполнены с помощью пакета R ComplexHeatmap9. Пространственное распределение ячеекВычислить биоинформационно расстояния между клетками (например, иммунными и опухолевыми клетками; Рисунок 6A, B) на основе координат ячеек, полученных при анализе изображений. Используйте медианное и среднее расстояния между интересующими типами клеток, чтобы сравнить близость клеток во всех выборках когорты. Пространственно-описательные функцииИспользуйте функцию G-кросса ближайшего соседа крестового типа, доступную через пакет10 R spatstat, чтобы определить вероятность того, что интересующая клетка X (например, опухолевая клетка) встретится с ближайшей клеткой Y (например, Т-клеткой) в определенном радиусе вокруг клетки X. Рассчитайте площадь под эмпирической кривой, чтобы получить числовое значение, представляющее опухолевую инфильтрацию CD3+ Т-клеток вокруг опухолевых клеток11 (рис. 6C). Используйте другие пространственные описательные функции, такие как F-функция или J-функция12. Иммунологический анализВычислите иммунобалл (I), разработанный командой Galon7,8, используя плотность CD3+ и CD8+ Т-клеток в центре опухоли и инвазивный край опухоли.ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка колеблется от I0 до I4. Низкая плотность CD3+ и CD8+ Т-клеток в центре и на краю опухоли связана с оценкой I0, в то время как высокая плотность CD3+ и CD8+ Т-клеток в обеих областях связана с оценкой I4. Недавно прогностическое воздействие Immunocore было подтверждено в исследовании с образцами 2,681 пациента с раком толстой кишки I-III стадии из 14 центров в 13 странах7. Однако для расчета Immunoscore требуется хирургически резецированный образец, содержащий как центр, так и край опухоли. Для биопсий, которые обычно не имеют запаса, недавно был разработан адаптированный к биопсии иммунобалл13. Чтобы вычислить адаптированный к биопсии иммунобалл, преобразуйте значение плотности CD3+ и CD8+ Т-клеток в процентиль, а затем используйте средний процентиль CD3+ и CD8+ Т-клеток для оценки в одну из трех категорий (т. е. низкий, средний и высокий)13. Анализ горячих точекИспользуйте анализ горячих точек с помощью функции квадратного счета (spatstat)10 для сравнения плотности различных типов клеток в наиболее инфильтрированной области ткани. Например, можно вычислить оценку «Immunoscore-like», используя значение плотности CD3 и CD8 Т-клеток наиболее инфильтрированных квадратов ткани (рис. 7). Применяют этот метод для анализа любого типа клеток с неоднородным распределением по тканям.