腫瘍微小環境の臨床的および生物学的評価のための空間画像解析と組み合わせたマルチプレックス免疫蛍光法

本プロトコルで使用されているすべてのサンプルは、地元の倫理委員会によって承認され、管轄当局によって承認された研究からのものです。研究のすべての参加者は、書面によるインフォームドコンセントを提供しました。トライアルは ClinicalTrials.gov に登録されています(NCT03608046)。 1.マルチプレックス免疫蛍光法 FFPE セクショニング組織を4%パラホルムアルデヒドで固定し、固定した組織をパラフィンに包埋する。 5 μmの切片を切り取り、粘着顕微鏡スライドの上に置きます。 スライドを室温(RT)で一晩乾燥させます。 脱パラフィンおよび内因性ペルオキシダーゼ阻害スライドをトルエン(各3回5分間)とメタノール(各3回5分間)にドラフトフードの下に沈めて、組織を脱ろうします。 メタノールで希釈した3%過酸化水素にスライドをヒュームフードの下で20分間沈めることにより、内因性ペルオキシダーゼを阻害します。 スライドを蒸留(d)H2O(1xで3分間)ですすぐ。 マルチプレックス免疫蛍光染色0.1% TritonX-100で補完した10 mMクエン酸塩(pH 6)またはEDTA(pH 9)バッファーを含む300 mL染色ジャーにスライドを沈めます。注:使用するバッファー(pH 6またはpH 9)は、染色する抗原によって異なります( 表1を参照)。 蓋を閉めた状態で染色ジャーを電子レンジで最大電力(例:.、900 W)で3〜5分間置きます バッファーが沸騰し始めるまで。注意: 沸騰に最適な時間は、マイクロ波とバッファーの容量によって異なります。完璧なタイミングを見つけるには、調整が必要になる場合があります。一部の脆弱な抗原や、脆弱で接着性の低い標本(オルガノイドやスフェロイドなど)では、マイクロ波沸騰が厳しすぎる場合があります。この場合、代わりに圧力鍋を使用できます。 閉じた染色ジャーを低電力(90 Wなど)の電子レンジに15分間入れて、バッファーを沸騰に近い温度に保ちます。 電子レンジを最大電力で90秒間加熱する最後のステップを実行します。 電子レンジからジャーを取り出し、バッファーをRTで15分間冷却します。 スライドをdH2Oでそれぞれ3回5分間、0.1%トゥイーン20(TBS-T)を含むトリス緩衝生理食塩水で1回5分間すすぎます。 ペーパータオルでスライドを吸い取ってTBS-Tを取り外します スライド(フラット)を染色室トレイまたは顕微鏡スライドボックスに置きます( 材料表を参照)。 疎水性ペンで組織を囲みます。 TBS-Tに溶解した5%ウシ血清アルブミン(BSA)で組織を30分間覆うことで、非特異的結合部位をブロックします。 ペーパータオルでスライドを吸い取ってブロッキングバッファーを取り外します。注意: ブロッキングステップの後にスライドをすすがないでください。 組織を約300 μLの溶液で覆い、1%BSA TBS-Tで希釈した一次抗体( 表1を参照)で組織を60分間インキュベートします。 スライドをTBS-Tで3分間3回すすぎます。 組織を約300 μLの溶液で覆い、ポリHRP二次抗体( 表1を参照)で組織を40分間インキュベートします。 スライドをTBS-Tで3分間3回すすぎます。 組織を約300 μLの溶液で覆うことにより、ホウ酸緩衝液(0.1 Mホウ酸塩、pH 7.8、3 M NaCl)で200倍希釈した蛍光クロム-チラミド試薬(表1を参照)で組織を10分間インキュベートします。 スライドをTBS-Tで3分間3回すすぎます。 すべてのTSA染色が実行されるまで、手順1.3.1〜1.3.16を繰り返します。 1%BSA TBS-Tで希釈した最後の一次抗体( 表1参照)を用いて組織を4°Cで一晩インキュベートします。注:インキュベーションは一晩行われるため、染色チャンバートレイまたは顕微鏡スライドボックスを覆い、ボックスの底(スライドの下)のペーパータオルにdH2Oを追加して、インキュベーション中に組織が乾燥しないようにすることが重要です。 TBS-Tで組織をそれぞれ5分間3回すすぎます。 1%BSA TBS-Tで200倍希釈した二次抗体(蛍光色素と直接結合)で組織を120分間インキュベートします。 TBS-Tで組織をそれぞれ5分間3回すすぎます。 組織を10%BSA TBS-Tで1,000倍に希釈したビスベンズイミド(20 mM)中で5分間インキュベートすることにより、核を染色します。注意: ビスベンズイミドはDAPIに置き換えることができますが、後者はより有毒であり、ヒュームフードの下で慎重に取り扱う必要があります。 組織をdH2Oでそれぞれ3分間3回すすぎます。 蛍光封入剤とホウケイ酸カバーガラスを使用してスライドをマウントします。 2.スライドスキャン スライドを蛍光スライドスキャナーで20倍の倍率でスキャンしてデジタル化します(スライドスキャナーの詳細は 材料表に記載されています)。メモ: 最適なマルチプレックスの代表的なスキャンを 図1に示します。 3. 画像解析 スキャンを画像解析ソフトウェア(ファイル>オープンイメージ)にインポートします。 分類子 タブに移動し、DenseNet AI V2 プラグインを選択します。 DenseNet AI V2 プラグインをトレーニングして、1 つの画像で約 500 個の核を囲むことで核を認識します。 いくつかのスライド(約10)でいくつかの核(50)を囲むことにより、同じバッチからの他のいくつかのスライドとmIF染色の異なるバッチでAIをトレーニングします。注意: AIプラグインの使用方法の詳細な手順は、ソフトウェアマニュアルに記載されています。核検出にAIを使用することはオプションです。使用する画像解析ソフトウェアに応じて、核を検出する他の方法が利用可能である。 トレーニング済みの AI を保存します ([分類子アクション] > [保存])。 [注釈] タブに移動し、ペン注釈ツールを使用して、腫瘍の中心や腫瘍の余白など、関心領域 (ROI) ごとに注釈を作成します。 必要に応じて、折り目のある領域とぼやけて見える領域を 除外注釈ツールで削除します。注:mIFに使用された切片に隣接する切片のヘマトキシリン-エオジン染色は、mIF染色の前に実行して、腫瘍細胞が標本に存在することを確認し、解剖病理学者がROIを決定するのに役立ちます。 [分析] タブに移動し、HighPlex FL アルゴリズム ([設定アクション] > [HighPlex FL >の読み込み]) を選択します。 [色素 の選択 ]タブを選択し、目的の色素を選択します。 核 検出 タブで、 核セグメンテーション タイプ に移動し、AI カスタム を選択します。 核セグメンテーション分類器で、手順 3.5 で保存した AI を選択します。 [膜 および細胞質の検出 ]タブで、細胞質の最大半径(この研究では1.5を使用)と膜色素の数を選択します。 各色素について、核陽性閾値、細胞質陽性閾値、および膜陽性閾値を選択します。注:閾値は染色ごとに異なるため、スライドのバッチごとおよび抗原染色ごとに調整する必要があります。ビュー設定ツール(ビュー設定>ビュー設定)を使用すると、強度ピークの最後(右側)にある強度値を使用して、適切なしきい値を選択するのに役立ちます。 各色素について、完全性の核、膜、および細胞質の割合の値を選択します。注:このパラメータは、染色の異なる2つの細胞が互いに接近している場合の誤検出を回避するために重要です(図2)。 アルゴリズムを保存します ([設定アクション] > [保存])。 ROI の分析 (アノテーション レイヤーの分析>)。 [ 結果 ]タブに移動し、[オブジェクト データ]内のすべての データ を選択します(ctrl + A)。 データを.csv形式でエクスポートします(右クリック>[オブジェクトデータをエクスポート]>。Csv)。注:このテーブルには、位置(Xmin、Xmax;Ymin、Ymax)および分析された各セルの各マーカーの陽性率。 4. Rを用いたバイオインフォマティクス 注: 次の手順の詳細を提供する R スクリプトは、GitHub (benidovskaya/Ring: マルチプレックス免疫蛍光染色の分析のためのパイプライン) で入手できます。[github.com]) エクスポートされたテーブルを使用して、まず共局在染色に基づいて異なる細胞タイプを定義します。例えば、細胞傷害性T細胞をダブルポジティブCD3+/CD8+細胞で定義します。 次に、画像解析ソフトウェアとggplot2(図 3).これらのデータを使用して、いくつかのタイプの分析を実行できます。密度解析注: 最も単純な解析は密度解析です。生検用のスライド全体または組織の特定の領域を使用して、すべての細胞タイプの密度分析を実行します。たとえば、腫瘍の中心にあるCD3+およびCD8+ T細胞の密度と腫瘍の縁を計算します(図4A-C)。 これらの密度を計算するには、画像解析ソフトウェアを使用して、各細胞の表現型と座標を含むサンプルごとの特定のデータフレームを生成します。R上のクラスタリング関数(k-最近傍)を使用して、調査対象の生検の境界を使用してポリゴンオブジェクトを作成し、その中の関心のある細胞タイプの密度を計算します。注:これにより、生物学的仮説に応じて、さまざまな条件(さまざまな時点、治療タイプ、組織タイプ、治療への反応など)および局在(腫瘍の中心、腫瘍の縁、間質線維症、壊死領域)の間で異なる細胞タイプの密度を比較できます。癌細胞、腫瘍周囲細胞、および腫瘍浸潤細胞の間の近接性が高いため、画像解析ソフトウェアは、免疫細胞と癌細胞としてのダブルポジティブ細胞を同時に検出する可能性があります。その場合、これらのダブルポジティブ細胞が何であるかに言及することによって、この問題をバイオインフォマティクス的に修正する必要があります。この場合、CD3+CD8+サイトケラチン+細胞は、サイトケラチン陽性が浸潤リンパ球周囲の腫瘍細胞によるものであったため、細胞傷害性細胞としてタグ付けされた。 ヒートマップ異なるパネルからの各細胞タイプの密度を使用し、正規化(スケーリングセンタリングなど)を適用して、サンプル集団における細胞の存在量を表すヒートマップ(図5)を描画します。 細胞密度に基づく階層的な教師なしクラスタリングを使用して、類似したTME組成を有する患者をクラスタリングし、これらのクラスタを治療反応や生存などの臨床パラメータと相関させる。注: ヒートマップとクラスタ化は、R ComplexHeatmap パッケージ9 を使用して簡単に実行できます。 空間セル分布細胞間の距離をバイオインフォマティクス的に計算します(例:免疫細胞と腫瘍細胞; 図6A、B)に基づく、画像解析により提供された細胞座標。対象の細胞タイプ間の中央値と平均距離を使用して、コホートのすべてのサンプルの細胞近接性を比較します。 空間記述関数R spatstatパッケージ10を通じて利用可能なクロス型最近傍Gクロス関数を使用して、細胞Xの周りの特定の半径内で、関心のある細胞X(例えば、腫瘍細胞)が、最も近い細胞Y(例えば、T細胞)と出会う確率を決定する。 経験曲線下面積を算出し、腫瘍細胞11 周辺のCD3+ T細胞の腫瘍浸潤を表す数値を得た(図6C)。F 関数や J 関数などの他の空間記述関数を使用します12. イムノスコア解析腫瘍の中心にあるCD3 +およびCD8 + T細胞の密度と腫瘍の浸潤性マージンを使用して、ガロン7,8のチームによって開発されたイムノスコア(I)を計算します。注:スコアの範囲はI0からI4です。腫瘍の中心および辺縁におけるCD3+およびCD8+ T細胞の両方の低密度はI0のスコアと関連し、両方の領域のCD3+およびCD8+ T細胞の高密度はI4のスコアと関連している。最近、イムノコアの予後への影響は、13か国の14施設の2,681人のステージI〜IIIの結腸がん患者のサンプルを使用した研究で検証されました7。ただし、計算するには、Immunoscoreには、腫瘍の中心と縁の両方を含む外科的に切除された標本が必要です。通常マージンがない生検の場合、生検に適応したイムノスコアが最近開発されました13。 生検に適応したイムノスコアを計算するには、CD3+およびCD8+ T細胞密度の値をパーセンタイルに変換し、CD3+およびCD8+ T細胞の平均パーセンタイルを使用して、3つのカテゴリ(低、中、高)のいずれかにスコアを付けます13。 ホットスポット分析ホットスポット分析を使用して、クワッドカウント機能(spatstat)10を使用して、組織の最も浸潤した領域における異なる細胞タイプの密度を比較します。例えば、最も浸潤した組織の正方形のCD3およびCD8 T細胞密度の値を用いて「イムノスコア様」スコアを計算することができる(図7)。この方法を、組織全体に不均一な分布を持つ任意の細胞タイプの分析に適用します。