מולטיפלקס אימונופלואורסנציה בשילוב עם ניתוח תמונה מרחבית להערכה קלינית וביולוגית של מיקרו-סביבה של הגידול

כל הדגימות המשמשות בפרוטוקול הנוכחי הגיעו ממחקר שאושר על ידי ועדות האתיקה המקומיות ואושר על ידי הרשות המוסמכת. כל המשתתפים במחקר סיפקו הסכמה מדעת בכתב. גירסת הניסיון רשומה ב-ClinicalTrials.gov (NCT03608046). 1. מולטיפלקס immunofluorescence חלוקת FFPEלתקן את הרקמה ב 4% paraformaldehyde, ולהטביע את הרקמה הקבועה בפרפין. חותכים חתכים של 5 מיקרומטר, ומניחים אותם על שקופיות מיקרוסקופ דביק. יבשו את המגלשות למשך הלילה בטמפרטורת החדר (RT). עיכוב פראפיניזציה ופרוקסידאזות אנדוגניותיש לטבול את הרקמות על ידי טבילת המגלשות בטולואן (3x למשך 5 דקות כל אחת) ובמתנול (3x למשך 5 דקות כל אחת) תחת מכסה אדים. לעכב את peroxidases אנדוגני על ידי טבילת שקופיות 3% מי חמצן מדולל מתנול במשך 20 דקות תחת מכסה אדים. שטפו את המגלשות ב-H2Oמזוקק (1x למשך 3 דקות). צביעת אימונופלואורסנציה מולטיפלקסהשקיעו את המגלשות בצנצנת צביעה של 300 מ”ל המכילה 10 mM ציטראט (pH 6) או חיץ EDTA (pH 9) בתוספת 0.1% TritonX-100.הערה: המאגר שבו נעשה שימוש (pH 6 או pH 9) תלוי באנטיגן המוכתם (ראה טבלה 1). מניחים את צנצנת הצביעה כשהמכסה סגור במיקרוגל למשך 3-5 דקות בעוצמה מרבית (למשל, 900 W) עד שהמאגר מתחיל לרתיחה.הערה: הזמן האופטימלי להרתחה תלוי במיקרוגל ובנפח החיץ. ייתכן שיהיה צורך בהתאמות כדי למצוא את העיתוי המושלם. עבור אנטיגנים שבירים מסוימים או דגימות שבירות ופחות דבקות (למשל, אורגנואידים וספרואידים), הרתחה במיקרוגל יכולה להיות קשה מדי. במקרה זה, סיר לחץ יכול לשמש במקום. שמור את המאגר בטמפרטורת רתיחה קרובה על ידי הנחת צנצנת הכתמים הסגורה במיקרוגל על עוצמה נמוכה (למשל, 90 W) למשך 15 דקות. בצע את השלב האחרון של חימום על ידי הצבת המיקרוגל בעוצמה מקסימלית למשך 90 שניות. הוציאו את הצנצנת מהמיקרוגל ותנו למאגר להתקרר למשך 15 דקות ב-RT. שטפו את המגלשות 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחת ב-dH2O ופעם אחת במשך 5 דקות במי מלח חוצצים בתריס המכילים 0.1% Tween 20 (TBS-T). הסר את TBS-T על-ידי מחיקת השקופיות על מגבת נייר הניחו את השקופיות (שטוחות) על מגש תא צביעה או קופסת שקופיות במיקרוסקופ (ראו טבלת חומרים). הקיפו את הרקמה בעט הידרופובי. חסום את אתרי הקישור הלא ספציפיים על ידי כיסוי הרקמה באלבומין 5% בסרום בקר (BSA) מומס ב-TBS-T למשך 30 דקות. הסר את מאגר החסימה על-ידי מחיקת השקופיות על מגבת נייר.הערה: אין לשטוף את השקופיות לאחר שלב החסימה. דגרו על הרקמה במשך 60 דקות עם הנוגדן הראשוני (ראה טבלה 1) מדולל ב-1% BSA TBS-T על ידי כיסוי הרקמה בכ-300 מיקרוליטר של התמיסה. שטפו את המגלשות 3 פעמים במשך 3 דקות כל אחת עם TBS-T. דגרו על הרקמה במשך 40 דקות עם נוגדן משני poly-HRP (ראו טבלה 1) על ידי כיסוי הרקמה בכ-300 מיקרוליטר של התמיסה. שטפו את המגלשות 3 פעמים במשך 3 דקות עם TBS-T. לדגור על הרקמה במשך 10 דקות עם מגיב פלואורוכרום-טירמיד (ראה טבלה 1) מדולל פי 200 בחיץ בוראט (0.1 M borate, pH 7.8, 3 M NaCl) בתוספת זמנית עם 0.003% H 2 O2 על ידי כיסוי הרקמה עם כ 300 μL של התמיסה. שטפו את המגלשות 3 פעמים במשך 3 דקות עם TBS-T. חזור על שלבים 1.3.1-1.3.16 עד לביצוע כל צביעת TSA. יש לדגור על הרקמה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C כאשר הנוגדן הראשוני האחרון (ראה טבלה 1) מדולל ב-1% BSA TBS-T.הערה: מכיוון שהדגירה היא למשך הלילה, חשוב לכסות את מגש תא הצביעה או את קופסת השקופיות במיקרוסקופ ולהוסיף dH2O על מגבת נייר בתחתית הקופסה (מתחת לשקופיות) כדי לוודא שהרקמות אינן מתייבשות במהלך הדגירה. שטפו את הרקמה 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם TBS-T. לדגור על הרקמה במשך 120 דקות עם הנוגדן המשני (בשילוב ישיר עם פלואורוכרום) מדולל פי 200 ב-1% BSA TBS-T. שטפו את הרקמה 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחת עם TBS-T. הכתימו את הגרעינים על ידי דגירה של הרקמה למשך 5 דקות בביסבנזימיד (20 מילימטר) מדולל פי 1,000 ב-10% BSA TBS-T.הערה: ביסבנזימיד יכול להיות מוחלף על ידי DAPI, אבל האחרון הוא רעיל יותר ויש לטפל בזהירות תחת מכסה מנוע אדים. שטפו את הרקמה 3x במשך 3 דקות כל אחד ב-dH2O. הרכיבו את המגלשות באמצעות מדיום הרכבה פלואורסצנטי ומשקפי כיסוי בורוסיליקט. 2. סריקת שקופיות הפוך את השקופיות לדיגיטליות על-ידי סריקתן בסורק שקופיות פלואורסצנטי בהגדלה של פי 20 (פרטי סורק השקופיות מופיעים בטבלת החומרים).הערה: סריקה מייצגת של מולטיפלקס אופטימלי מוצגת באיור 1. 3. ניתוח תמונות ייבא את הסריקות לתוכנה לניתוח תמונות (File > Open Image). עבור אל מסווגים הכרטיסייה ובחר את תוסף DenseNet AI V2 . אמן את תוסף DenseNet AI V2 לזהות גרעינים על ידי הקפת כ-500 גרעינים בתמונה אחת. אמן את הבינה המלאכותית על מספר שקופיות אחרות מאותה אצווה ואצוות שונות של צביעת mIF על ידי הקפת מספר גרעינים (50) במספר שקופיות (בסביבות 10).הערה: הוראות מפורטות כיצד להשתמש בתוסף AI ניתן למצוא במדריך התוכנה. השימוש בבינה מלאכותית לזיהוי גרעינים הוא אופציונלי. שיטות אחרות לזיהוי גרעינים זמינות בהתאם לתוכנת ניתוח התמונה בה נעשה שימוש. שמור את ה- AI המאומן (פעולות מסווגות > שמור). עבור אל הכרטיסיה ביאורים וצור ביאור עבור כל אזור עניין (ROI), כגון מרכז הגידול ושולי הגידול, באמצעות הכלי ביאור עט. במקרה הצורך, הסירו את האזורים עם הקיפולים ואת האזורים שנראים מטושטשים בעזרת הכלי ביאור אי-הכללה.הערה: צביעת Hematoxylin-eosin של קטע הסמוך לזה המשמש עבור mIF יכולה להתבצע לפני צביעת mIF כדי להבטיח שתאי הגידול נמצאים בדגימה ולסייע לאנטומופתולוגים לקבוע את החזר ההשקעה. עבור אל הכרטיסייה ניתוח ובחר את האלגוריתם HighPlex FL (פעולות הגדרות > טען >- HighPlex FL). בחר בכרטיסייה בחירת צבע ובחר את הצבע המעניין. בכרטיסיה זיהוי גרעיני, עבור אל סוג פילוח גרעיני ובחר מותאם אישית AI. ב מסווג סגמנטציה גרעינית, בחר את הבינה המלאכותית שנשמרה בשלב 3.5. בכרטיסייה זיהוי ממברנה וציטופלסמה , בחר את רדיוס הציטופלסמה המרבי (במחקר זה, נעשה שימוש ב -1.5) ואת מספר צבעי הממברנה. עבור כל צבע, בחר את הסף החיובי של הגרעין, את הסף החיובי של הציטופלסמה ואת הסף החיובי של הממברנה.הערה: הסף שונה עבור כל צביעה ויש להתאים אותו לכל קבוצה של שקופיות וכל אנטיגן מוכתם. שימוש בכלי הגדרות תצוגה (View > View Settings) יכול לסייע בבחירת סף מתאים באמצעות ערך העוצמה בסוף שיא העוצמה (מימין). עבור כל צבע, בחר את הגרעין, הממברנה ואחוז הציטופלסמה של ערכי השלמות.הערה: פרמטר זה חשוב כדי למנוע זיהוי חיובי מוטעה כאשר שני תאים עם צביעה שונה קרובים זה לזה (איור 2). שמור את האלגוריתם (Settings Actions > Save). ניתוח החזר ההשקעה (ניתוח שכבת הביאור >). עבור אל הכרטיסיה תוצאות ובחר את כל הנתונים בנתוני אובייקט (ctrl + A). יצא את הנתונים בתבנית .csv (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני > ייצוא > נתוני אובייקט . Csv).הערה: טבלה זו מכילה את המיקום (Xmin, Xmax; Ymin, Ymax) והחיוביות של כל סמן של כל תא מנותח. 4. ביואינפורמטיקה באמצעות R הערה: סקריפט R המספק פרטים נוספים על השלבים הבאים זמין ב- GitHub (benidovskaya/Ring: Pipeline לניתוח כתמים אימונופלואורסצנטיים מרובים. [github.com]) באמצעות הטבלה המיוצאת, הגדר תחילה את סוגי התאים השונים בהתבסס על צביעות הקולוקליזציה. לדוגמה, הגדר תאי T ציטוטוקסיים על ידי תאי CD3+/CD8+ חיוביים כפולים. לאחר מכן, בנה מחדש תמונה פשוטה של השקופית על תרשים נקודה באמצעות הקואורדינטות המיוצאות מתוכנת ניתוח התמונות ו- ggplot2 (תרשים 3). באמצעות נתונים אלה, ניתן לבצע מספר סוגים של ניתוח:ניתוח צפיפותהערה: הניתוח הפשוט ביותר הוא ניתוח צפיפות.בצע ניתוח צפיפות עבור כל סוגי התאים באמצעות השקף כולו עבור ביופסיות או אזור מסוים של הרקמה. לדוגמה, חשבו את צפיפות תאי T CD3+ ו-CD8+ במרכז הגידול ובשולי הגידול (איור 4A-C). כדי לחשב צפיפויות אלה, השתמש בתוכנה לניתוח תמונות כדי לייצר מסגרת נתונים ספציפית לכל דגימה עם הפנוטיפ והקואורדינטות של כל תא. באמצעות פונקציית אשכולות (k-השכן הקרוב ביותר) על R, יוצרים אובייקט מצולע באמצעות גבולות הביופסיה הנחקרת, ומחשבים את צפיפות סוגי התאים המעניינים בתוכו.הערה: זה מאפשר להשוות את הצפיפויות של סוגי תאים שונים בין תנאים שונים (כגון נקודות זמן שונות, סוגי טיפול, סוגי רקמות, ותגובה לטיפול) ולוקליזציה (מרכז הגידול, שולי הגידול, סטרומה פיברוזיס ואזור נמק) בהתאם להשערה הביולוגית. בשל הקרבה הגבוהה בין תאים סרטניים, תאים פרי-גידוליים ותאים חודרי גידול, תוכנת ניתוח התמונה עשויה לזהות תאים חיוביים כפולים כתאי חיסון ותאים סרטניים בו זמנית. במקרה כזה, יש לתקן בעיה זו ביואינפורמטית על ידי אזכור מהם התאים החיוביים הכפולים הללו. במקרה זה, תאי CD3 + CD8 + ציטוקרטין + תויגו כתאים ציטוטוקסיים מכיוון שהחיוביות הציטוקרטין נבעה מתאי הגידול המקיפים את הלימפוציטים החודרים. מפות חוםבאמצעות הצפיפות של כל סוג תא מלוחות שונים ועל-ידי החלת נורמליזציה (למשל, מרכוז קנה מידה), ציירו מפות חום (איור 5) המייצגות את שפע התאים באוכלוסיית הדגימות. באמצעות אשכולות היררכיים ללא פיקוח המבוססים על צפיפות תאים, מקבצים מטופלים בעלי הרכבים דומים של TME, ומתאמים אשכולות אלה עם פרמטרים קליניים כגון תגובה לטיפול והישרדות.הערה: מפות חום ואשכולות ניתן לבצע בקלות עם חבילת R ComplexHeatmap9. התפלגות תאים מרחביתחישוב ביואינפורמטי של המרחקים בין התאים (למשל, תאי מערכת החיסון ותאי הגידול; איור 6A, B) בהתבסס על קואורדינטות התאים שסופקו על-ידי ניתוח התמונות. השתמש במרחקים החציוניים והממוצעים בין סוגי התאים המעניינים כדי להשוות את קרבת התאים בכל הדגימות של עוקבה. פונקציות תיאוריות מרחביותהשתמש בפונקציית G-cross של השכן הקרוב ביותר, הזמינה דרך חבילת R spatstat10, כדי לקבוע את ההסתברות לתא מעניין, X (למשל, תא סרטני), לפגוש את התא הקרוב ביותר, Y (למשל, תא T), ברדיוס מסוים סביב תא X. חשב את השטח מתחת לעקומה האמפירית כדי לקבל ערך מספרי המייצג את חדירת הגידול של תאי CD3+ T סביב תאי הגידול11 (איור 6C). השתמש בפונקציות תיאוריות מרחביות אחרות, כגון פונקציית F או פונקציית J12. ניתוח אימונוסקורחשב את Immunoscore (I), שפותח על ידי הצוות של גלאון7,8, על ידי שימוש בצפיפות של תאי T CD3+ ו- CD8+ במרכז הגידול ובשוליים הפולשניים של הגידול.הערה: הניקוד נע בין I0 ל- I4. צפיפות נמוכה של תאי T CD3+ ו- CD8+ במרכז הגידול ובשולי הגידול קשורה לציון I0, בעוד צפיפות גבוהה של תאי T CD3+ ו- CD8+ בשני האזורים קשורה לציון I4. לאחרונה, ההשפעה הפרוגנוסטית של האימונוקור אומתה במחקר עם דגימות מ -2,681 חולי סרטן המעי הגס בשלב I-III מ -14 מרכזים ב -13 מדינות7. עם זאת, כדי להיות מחושב, Immunoscore דורש דגימה כירורגית המכילה הן את המרכז והן את השוליים של הגידול. עבור ביופסיות, שבדרך כלל חסרות שוליים, פותחה לאחרונה Immunoscore מותאמת ביופסיה13. כדי לחשב את Immunoscore המותאם לביופסיה, המר את הערך של צפיפות תאי T CD3+ ו- CD8+ לאחוזון, ולאחר מכן השתמש באחוזון הממוצע של תאי T CD3+ ו- CD8+ לניקוד לאחת משלוש קטגוריות (כלומר, נמוך, בינוני וגבוה)13. ניתוח נקודות חמותהשתמש בניתוח נקודות חמות, באמצעות הפונקציה quadratcount (spatstat)10, כדי להשוות את הצפיפויות של סוגי תאים שונים באזור המסתנן ביותר של הרקמה. לדוגמה, אפשר לחשב ציון “דמוי אימונוסקורק” באמצעות הערך של צפיפות תאי CD3 ו-CD8 T של הריבועים החדירים ביותר של הרקמה (איור 7). החל שיטה זו לניתוח של כל סוג תא עם התפלגות לא הומוגנית על פני הרקמה.