Immunofluorescence multiplex combinée à l’analyse d’images spatiales pour l’évaluation clinique et biologique du microenvironnement tumoral

Tous les échantillons utilisés dans le présent protocole proviennent d’une étude approuvée par les comités d’éthique locaux et autorisée par l’autorité compétente. Tous les participants à l’étude ont fourni un consentement éclairé écrit. L’essai est enregistré auprès de ClinicalTrials.gov (NCT03608046). 1. Immunofluorescence multiplex Sectionnement FFPEFixez le tissu dans du paraformaldéhyde à 4% et incorporez le tissu fixe dans de la paraffine. Coupez des sections de 5 μm et placez-les sur des lames de microscope adhésif. Sécher les lames pendant la nuit à température ambiante (RT). Désaffinisation et inhibition des peroxydases endogènesDécirer les tissus en immergeant les lames dans du toluène (3x pendant 5 min chacune) et du méthanol (3x pendant 5 min chacune) sous une hotte. Inhiber les peroxydases endogènes en immergeant les lames dans du peroxyde d’hydrogène à 3% dilué dans du méthanol pendant 20 min sous une hotte. Rincer les lames dans du distillé (d)H2O(1x pendant 3 min). Coloration par immunofluorescence multiplexImmergez les lames dans un pot de coloration de 300 mL contenant 10 mM de citrate (pH 6) ou d’EDTA (pH 9) complété par du TritonX-100 à 0,1%.REMARQUE : Le tampon utilisé (pH 6 ou pH 9) dépend de l’antigène coloré (voir le tableau 1). Placez le pot de coloration avec le couvercle fermé au micro-ondes pendant 3 à 5 minutes à puissance maximale (p. ex., 900 W) jusqu’à ce que le tampon commence à bouillir.REMARQUE: Le temps optimal pour l’ébullition dépend du micro-ondes et du volume du tampon. Des ajustements peuvent être nécessaires pour trouver le timing parfait. Pour certains antigènes fragiles ou spécimens fragiles et moins adhérents (p. ex. organoïdes et sphéroïdes), l’ébullition au micro-ondes peut être trop dure. Dans ce cas, un autocuiseur peut être utilisé à la place. Maintenir le tampon à une température proche de l’ébullition en plaçant le pot à colorer fermé au micro-ondes à faible puissance (p. ex. 90 W) pendant 15 minutes. Effectuez la dernière étape du chauffage en mettant le micro-ondes à puissance maximale pendant 90 s. Retirer le pot du micro-ondes et laisser refroidir le tampon pendant 15 min à TA. Rincer les lames 3x pendant 5 min chacune dans dH2Oet 1x pendant 5 min dans une solution saline tamponnée contenant 0,1% de Tween 20 (TBS-T). Retirez le TBS-T en épongeant les lames sur une serviette en papier Placez les lames (à plat) sur un plateau de chambre de coloration ou une boîte de lames de microscope (voir le tableau des matériaux). Encerclez le tissu avec un stylo hydrophobe. Bloquer les sites de liaison non spécifiques en recouvrant le tissu de 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) dissoute dans le TBS-T pendant 30 min. Retirez la mémoire tampon bloquante en épongeant les lames sur une serviette en papier.REMARQUE: Ne rincez pas les lames après l’étape de blocage. Incuber le tissu pendant 60 min avec l’anticorps primaire (voir tableau 1) dilué dans 1% BSA TBS-T en recouvrant le tissu d’environ 300 μL de la solution. Rincer les lames 3x pendant 3 min chacune avec TBS-T. Incuber le tissu pendant 40 min avec l’anticorps secondaire poly-HRP (voir tableau 1) en recouvrant le tissu d’environ 300 μL de solution. Rincer les lames 3x pendant 3 min avec TBS-T. Incuber le tissu pendant 10 min avec un réactif fluorochrome-tyramide (voir tableau 1) dilué 200 fois dans un tampon de borate (0,1 M borate, pH 7,8, 3 M NaCl) complété extemporanément avec 0,003% H2O2 en recouvrant le tissu d’environ 300 μL de la solution. Rincer les lames 3x pendant 3 min avec TBS-T. Répétez les étapes 1.3.1 à 1.3.16 jusqu’à ce que toute la coloration TSA ait été effectuée. Incuber le tissu pendant une nuit à 4 °C avec le dernier anticorps primaire (voir tableau 1) dilué dans du TBS-T BSA à 1%.REMARQUE: Comme l’incubation dure pendant la nuit, il est important de couvrir le plateau de la chambre de coloration ou la boîte de lame du microscope et d’ajouter dH2O sur une serviette en papier au fond de la boîte (sous les lames) pour s’assurer que les tissus ne sèchent pas pendant l’incubation. Rincer le mouchoir 3x pendant 5 min chacun avec TBS-T. Incuber le tissu pendant 120 min avec l’anticorps secondaire (directement couplé au fluorochrome) dilué 200 fois dans 1% BSA TBS-T. Rincer le mouchoir 3x pendant 5 min chacun avec TBS-T. Colorer les noyaux en incubant le tissu pendant 5 min dans du bisbenzimide (20 mM) dilué 1 000 fois dans 10% BSA TBS-T.NOTE: Le bisbenzimide peut être remplacé par DAPI, mais ce dernier est plus toxique et doit être manipulé avec précaution sous une hotte. Rincer le mouchoir 3x pendant 3 min chacun endH2O. Montez les lames à l’aide d’un support de montage à fluorescence et de verres à couverture en borosilicate. 2. Numérisation des diapositives Numérisez les lames en les numérisant sur un scanner de lames à fluorescence à un grossissement de 20x (les détails du scanner de diapositives sont fournis dans le tableau des matériaux).REMARQUE : Un balayage représentatif d’un multiplex optimal est illustré à la figure 1. 3. Analyse d’images Importez les numérisations dans un logiciel d’analyse d’images (File > Open Image). Accédez à l’onglet Classificateurs et sélectionnez le plugin DenseNet AI V2 . Entraînez le plugin DenseNet AI V2 à reconnaître les noyaux en entourant environ 500 noyaux dans une image. Entraînez l’IA sur plusieurs autres lames du même lot et différents lots de coloration mIF en entourant plusieurs noyaux (50) sur plusieurs lames (environ 10).REMARQUE: Des instructions détaillées sur la façon d’utiliser le plugin AI peuvent être trouvées dans le manuel du logiciel. L’utilisation de l’IA pour la détection des noyaux est facultative. D’autres méthodes de détection des noyaux sont disponibles en fonction du logiciel d’analyse d’images utilisé. Enregistrez l’IA entraînée (actions du classificateur > sauvegarde). Accédez à l’onglet Annotations et créez une annotation pour chaque région d’intérêt (ROI), telle que le centre de la tumeur et la marge de la tumeur, à l’aide de l’outil d’annotation du stylet. Si nécessaire, supprimez les régions avec des plis et les régions qui apparaissent floues à l’aide de l’outil d’annotation d’exclusion.REMARQUE: La coloration à l’hématoxyline-éosine d’une section adjacente à celle utilisée pour la mIF peut être effectuée avant la coloration mIF pour s’assurer que les cellules tumorales sont présentes dans l’échantillon et pour aider les anatomopathologistes à déterminer les ROI. Accédez à l’onglet Analyse et sélectionnez l’algorithme HighPlex FL (Actions de paramètres > charge > HighPlex FL). Sélectionnez l’onglet Sélection du colorant , puis sélectionnez le colorant qui vous intéresse. Dans l’onglet Détection nucléaire, accédez à Type de segmentation nucléaire et sélectionnez Personnalisation de l’IA. Dans Nuclear Segmentation Classifier, sélectionnez l’IA enregistrée à l’étape 3.5. Dans l’onglet Détection de la membrane et du cytoplasme, choisissez le rayon maximal du cytoplasme (dans cette étude, 1,5 a été utilisé) et le nombre de colorants membranaires. Pour chaque colorant, sélectionnez le seuil positif du noyau, le seuil positif du cytoplasme et le seuil positif de la membrane.REMARQUE : Le seuil est différent pour chaque coloration et doit être ajusté pour chaque lot de lames et chaque antigène coloré. L’utilisation de l’outil Paramètres d’affichage (Paramètres d’affichage > d’affichage) peut vous aider à sélectionner un seuil adéquat en utilisant la valeur d’intensité à la fin du pic d’intensité (à droite). Pour chaque colorant, sélectionnez le pourcentage de noyau, de membrane et de cytoplasme des valeurs d’exhaustivité.REMARQUE : Ce paramètre est important pour éviter la détection de faux positifs lorsque deux cellules avec des colorations différentes sont proches l’une de l’autre (Figure 2). Enregistrez l’algorithme (Actions de paramètres > Enregistrer). Analysez les ROI (Analyze > Annotation Layer). Accédez à l’onglet Résultats et sélectionnez toutes les données dans Données d’objet (ctrl + A). Exportez les données dans .csv format (clic droit > Exporter > données d’objet . CSV).Remarque : Ce tableau contient la position (Xmin, Xmax; Ymin, Ymax) et la positivité de chaque marqueur de chaque cellule analysée. 4. Bioinformatique utilisant R REMARQUE: Un script R fournissant plus de détails sur les étapes suivantes est disponible sur GitHub (benidovskaya / Ring: Pipeline pour l’analyse des colorations d’immunofluorescence multiplexe. [github.com]) À l’aide du tableau exporté, définissez d’abord les différents types de cellules en fonction des colorations de colocalisation. Par exemple, définissez les lymphocytes T cytotoxiques par des lymphocytes CD3+/CD8+ doublement positifs. Ensuite, reconstruisez une image simplifiée de la diapositive sur un graphique à points à l’aide des coordonnées exportées du logiciel d’analyse d’images et de ggplot2 (Graphique 3). À l’aide de ces données, plusieurs types d’analyses peuvent être effectués :Analyse de densitéRemarque : L’analyse la plus simple est une analyse de densité.Effectuer une analyse de densité pour tous les types de cellules en utilisant la lame entière pour les biopsies ou une zone spécifique du tissu. Par exemple, calculer la densité des lymphocytes T CD3+ et CD8+ au centre de la tumeur et la marge de la tumeur (Figure 4A-C). Pour calculer ces densités, utilisez un logiciel d’analyse d’images pour produire une base de données spécifique par échantillon avec le phénotype et les coordonnées de chaque cellule. Grâce à une fonction de regroupement (k plus proche voisin) sur R, créez un objet polygonal en utilisant les bordures de la biopsie étudiée et calculez la densité des types de cellules d’intérêt à l’intérieur de celui-ci.REMARQUE: Cela permet de comparer les densités de différents types de cellules entre différentes conditions (telles que différents points temporels, types de traitement, types de tissus et réponse au traitement) et localisations (centre de la tumeur, marge de la tumeur, fibrose du stroma et zone de nécrose) en fonction de l’hypothèse biologique. En raison de la grande proximité entre les cellules cancéreuses, les cellules péritumorales et les cellules infiltrant la tumeur, le logiciel d’analyse d’images peut détecter les cellules doublement positives en tant que cellules immunitaires et cancéreuses en même temps. Dans ce cas, il faut corriger bio-informatique ce problème en mentionnant ce que sont ces cellules doublement positives. Dans ce cas, les cellules CD3 + CD8 + cytokératine + ont été marquées comme cellules cytotoxiques parce que la positivité de la cytokératine était due aux cellules tumorales entourant les lymphocytes infiltrants. Cartes thermiquesEn utilisant la densité de chaque type de cellule à partir de différents panels et en appliquant une normalisation (p. ex., centrage de mise à l’échelle), dessinez des cartes thermiques (Figure 5) représentant l’abondance des cellules dans la population d’échantillons. En utilisant le regroupement hiérarchique non supervisé basé sur la densité cellulaire, regrouper les patients ayant des compositions similaires de TME et corréler ces clusters avec des paramètres cliniques tels que la réponse au traitement et la survie.REMARQUE: Les cartes thermiques et la clusterisation peuvent être facilement effectuées avec le package R ComplexHeatmap9. Distribution cellulaire spatialeCalculer bio-informatique les distances entre les cellules (p. ex., cellules immunitaires et tumorales; Figure 6A, B) basée sur les coordonnées de cellule fournies par l’analyse d’image. Utilisez les distances médiane et moyenne entre les types de cellules d’intérêt pour comparer la proximité cellulaire dans tous les échantillons d’une cohorte. Fonctions descriptives spatialesUtilisez la fonction G-cross du plus proche voisin croisé, disponible via le package R spatstat10, pour déterminer la probabilité pour une cellule d’intérêt, X (par exemple, une cellule tumorale), rencontrant la cellule la plus proche, Y (par exemple, une cellule T), dans un certain rayon autour de la cellule X. Calculer l’aire sous la courbe empirique pour obtenir une valeur numérique représentant l’infiltration tumorale des lymphocytes T CD3+ autour des cellules tumorales11 (Figure 6C). Utilisez d’autres fonctions descriptives spatiales telles que la fonction F ou la fonction J12. Analyse des immunoscoresCalculer l’Immunoscore (I), développé par l’équipe de Galon7,8, en utilisant la densité des lymphocytes T CD3+ et CD8+ au centre de la tumeur et la marge invasive de la tumeur.REMARQUE: Le score varie de I0 à I4. Une faible densité de lymphocytes T CD3+ et CD8+ au centre et dans la marge de la tumeur est associée à un score I0, tandis qu’une densité élevée de lymphocytes T CD3+ et CD8+ dans les deux régions est associée à un score I4. Récemment, l’impact pronostique de l’Immunocore a été validé dans une étude avec des échantillons de 2 681 patients atteints d’un cancer du côlon de stade I-III provenant de 14 centres dans 13 pays7. Cependant, pour être calculé, Immunoscore nécessite un échantillon réséqué chirurgicalement contenant à la fois le centre et la marge de la tumeur. Pour les biopsies, qui manquent généralement de marge, un Immunoscore adapté à la biopsie a été récemment mis au point13. Pour calculer l’immunoscore adapté à la biopsie, convertissez la valeur de la densité des lymphocytes T CD3+ et CD8+ en centile, puis utilisez le percentile moyen des lymphocytes T CD3+ et CD8+ pour classer l’une des trois catégories suivantes (c.-à-d. faible, intermédiaire et élevé)13. Analyse des points chaudsUtilisez l’analyse des points chauds, en utilisant la fonction quadratcount (spatstat)10, pour comparer les densités de différents types de cellules dans la zone la plus infiltrée du tissu. Par exemple, il est possible de calculer un score de type « Immunoscore » en utilisant la valeur de la densité des lymphocytes T CD3 et CD8 des carrés les plus infiltrés du tissu (Figure 7). Appliquez cette méthode pour l’analyse de tout type de cellule avec une distribution non homogène à travers le tissu.